气相色谱测定食品中丙酸及其盐类

李 霞, 刘 旭, 李 玲, 王艳丽, 田其燕, 刘艳明*

(1. 山东省食品药品检验研究院, 山东 济南 250000; 2. 山东省环境执法局, 山东 济南 250000)

丙酸及其盐类是国内外食品加工中常用的防腐剂之一。应用于食品中的丙酸盐主要有丙酸钙和丙酸钠[1]。由其于优良的防霉性能,我国国标[2]规定丙酸及其盐类可作为防腐剂,用于面包、糕点、酱油、醋等食品中。丙酸及其盐类具有轻微的丙酸味,对热和光稳定,有吸湿性,可溶于水,微溶于甲醇和乙醇,不溶于苯及丙酮。在酸性条件下,产生游离丙酸,对霉菌、枯草杆菌、马铃薯杆菌等的生长有抑制作用,有广泛的抗菌作用。根据我国国标[2]规定,丙酸及其钠盐、钙盐(以丙酸计)在原粮中的限量为1.80 g/kg,在生湿面制品中的限量为0.25 g/kg,在豆类制品、面包、糕点、醋和酱油中的限量为2.50 g/kg。

目前测定食品中丙酸及其盐类的方法主要有离子色谱法[3]、气相色谱法[4-8]、液相色谱法[9]、气相色谱-质谱联用法[10]等。现有国标[11]及大部分文献[12-16]方法主要是通过水蒸气蒸馏提取样品中的丙酸再进行测定,前处理比较繁琐,在样品量大的情况下效率较低,给食品检验带来困难。有文献[17]报道,样品经酸化后提取丙酸,经气相色谱-质谱法测定,没有去除样品中的油脂,不但污染了仪器和色谱柱,而且气相色谱-质谱检测仪器成本较高,无法满足部分检测机构的要求。本方法根据丙酸的化学性质和所检测样品的不同,采用不同的提取方法。对含油脂少或不含油脂的样品(酱油、醋、豆腐乳、豆浆)采用直接提取法,对提取溶液pH值等条件进行了考察;对含油脂多的样品(桃酥、饼干、面包、月饼、元宵等)采用脱脂提取法,对丙酸进行pH溶解性的考察,pH≤2时,丙酸在正己烷中溶解性最小,丙酸提取率达到最大值。本方法简便、快速、灵敏度好、准确度高,可以满足检测的要求。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 7890型气相色谱仪,配有电子捕获检测器(FID)(美国Agilent公司);感量0.01 g和0.000 1 g的天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司); MS 3basic涡旋仪(德国IKA公司);SIGMA 3-18K离心机(德国SIGMA公司)。标准品:丙酸(分析纯,德国Dr. Ehrenstorfer公司);盐酸、氢氧化钠、氯化钠、无水硫酸钠(均为分析纯,国药集团化学试剂有限公司);正己烷、乙酸乙酯(均为色谱纯,美国Fisher公司);水为GB/T 6682规定的一级水。

1.2 色谱条件

色谱柱:HP-INNOWAX石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),载气为高纯氮气(纯度≥99.999%);进样量为1 μL;进样方式:分流进样(分流比为10∶1);恒流模式:载气流速为1 mL/min;氢气流速:30 mL/min;空气流速:400 mL/min;进样口温度:250 ℃;检测器温度:300 ℃。柱温采用程序升温程序:100 ℃保持2 min,以20 ℃/min的速度升至240 ℃,保持10 min。

1.3 标准溶液的配制

标准储备溶液:准确称取0.250 0 g丙酸标准品,用乙酸乙酯溶解并定容至25 mL,配制成质量浓度为10 g/L的标准储备液,于4 ℃冰箱中保存,有效期为6个月。

标准工作液:取适量标准储备液于10 mL容量瓶中,用乙酸乙酯配制成质量浓度为2.0 g/L的标准中间液,再用乙酸乙酯逐级稀释成2、10、50、200、500和1 000 mg/L的标准工作液。于4 ℃冰箱中保存,现用现配。

1.4 样品的制备

固体样品经组织捣碎机捣碎混匀后备用。

1.5 样品处理

1.5.1脱脂提取法

脱脂提取法适用于桃酥、饼干、面包、月饼、元宵等。称取2.00 g样品,加入10 mL水和1 mL 50%(体积分数)盐酸-水溶液,涡旋2 min。加入5.0 mL正己烷和2 g氯化钠,涡旋2 min,以8 000 r/min的速度离心5 min,弃去上清液。下层加入5 mL乙酸乙酯,涡旋2 min。以8 000 r/min的速度离心5 min,取上清液于10 mL容量瓶中,残渣再加入5 mL乙酸乙酯提取一次,合并两次提取液,摇匀。取2 mL溶液于15 mL离心管中,加入0.5 g无水硫酸钠,涡旋2 min,取上清液供GC测定。

1.5.2直接提取法

直接提取法适用于酱油、醋、豆腐乳、豆浆等。称取2.00 g样品,加入1 mL 50%(体积分数)盐酸-水溶液,涡旋2 min,加入5 mL乙酸乙酯,涡旋2 min,以8 000 r/min的速度离心5 min,取上清液置于10 mL容量瓶中。向残渣中加入5 mL乙酸乙酯，按前述方法再提取一次,合并两次提取液,摇匀。取2 mL溶液于15 mL离心管,加入0.5 g无水硫酸钠,涡旋2 min,取上清液供GC测定。

图 1 标准溶液、面包和豆腐乳中丙酸的气相色谱图Fig. 1 Gas chromatograms of propionic acid in standard solution, bread and bean curd

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的优化

丙酸是有机酸,属于极性物质。选择不同极性的色谱柱:HP-5色谱柱(弱极性)、DB-1701色谱柱(中等极性)和HP-INNOWAX色谱柱(强极性),在相同进样和分析条件下,对同一浓度的标准溶液进行检测。结果表明,弱极性的色谱柱响应值低,其分离效果远不及强极性色谱柱,所以选用强极性的HP-INNOWAX色谱柱进行试验。标准溶液、面包和豆腐乳中丙酸的色谱图见图1,丙酸的出峰时间为5.332 min。

2.2 前处理条件的优化

2.2.1pH值

丙酸的pKa值为4.873 2,不同的pH值条件下,丙酸在水和有机溶剂中的溶解性不同。为了提高方法的加标回收率,本文分别对脱脂提取法和直接提取法中的pH值进行了优化。

首先考察了脱脂提取法中不同pH值条件下丙酸在正己烷(脱脂溶剂)和乙酸乙酯(提取溶剂)中的提取率。用1 mL正己烷和1 mL乙酸乙酯分别提取1 mL不同pH值(1、2、3、5、7、9、11和13)的丙酸加标水溶液,以pH值为横坐标,以丙酸百分含量为纵坐标作图,如图2所示,当pH小于7时,随着pH值降低,丙酸在正己烷中溶解性降低,在乙酸乙酯中溶解性增大,因此pH值减小既可以减小在脱脂溶剂中的损失又可以提高提取溶剂的提取率。当pH大于7时,丙酸转化为丙酸盐溶解于水中,在正己烷和乙酸乙酯中溶解性降低,最后在强碱条件(pH≥11)下无法检测。

图 2 pH值对正己烷和乙酸乙酯提取率的影响(n=3)Fig. 2 Effects of pH values on the extraction rates of n-hexane and ethyl acetate (n=3)

图 3 脱脂提取法中pH值对加标回收率的影响(n=3)Fig. 3 Effects of pH values on the spiked recoveries by the degrease extraction method (n=3)

在上述研究的基础上,考察了样品溶液pH值对脱脂提取法的加标回收率的影响。样品加标水平为0.01、0.10和2.5 g/kg, pH值分别为1、2、3、5和7,采用1.5.1节方法进行前处理。结果如图3所示,pH值等于1和2时的加标回收率可达到92%以上,pH等于3时加标回收率有所下降,pH等于5～7时加标回收率明显下降,因此最佳pH条件为pH≤2。对50%(体积分数)盐酸-水溶液的体积进行考察,结果发现,加入50%(体积分数)盐酸-水溶液体积为1 mL时,样品的pH≤2,可满足实验要求。

对于不含油脂的样品(酱油、醋、豆腐乳、豆浆)采用直接提取法。基于上文乙酸乙酯提取率的研究,考察了直接提取法中样品溶液pH值对加标回收率的影响,前处理方法同1.5.2节。如图4所示,pH值对加标回收率有明显影响,pH等于1和2时的加标回收率可达到93%以上,pH等于3时加标回收率有所下降,pH等于5和7时丙酸加标回收率明显下降,因此直接提取法中样品溶液最佳pH条件为pH≤2。加入50%(体积分数)盐酸-水溶液体积为1 mL时,样品的pH≤2,可满足实验要求。

图 4 直接提取法中pH值对加标回收率的影响(n=3)Fig. 4 Effects of pH values on the spiked recoveries by the direct extraction method (n=3)

2.2.2脱脂溶剂

糕点、月饼等食品中的脂肪含量较高,样品经过有机溶剂提取后,大部分脂肪被提取出来。脱脂提取法对样品中脂肪的去除是前处理过程中非常重要的步骤。本文考察了正己烷、石油醚和环己烷3种溶剂对脱脂净化效果的影响。结果显示,使用3种脱脂溶剂都能达到很好的净化效果,经脱脂溶剂净化后,样品溶液变为无色透明。综合考虑脱脂溶剂的毒性和使用成本,本文采用正己烷作为脱脂溶剂。脱脂提取法虽然增加了提取步骤,但其很大程度上净化了基质,提高了方法的选择性。

2.2.3提取溶剂和提取次数

对比了3种溶剂(乙醚、乙酸乙酯和石油醚)的提取效果。结果表明,3种溶剂提取效率相差不大,但是石油醚和乙醚提取溶液时杂质峰相对较多,且乙醚和石油醚易挥发,因此本研究选用乙酸乙酯作为提取溶剂。

为进一步提高提取效率,对乙酸乙酯的提取次数进行考察,样品加标水平设置为0.05 g/kg,每次乙酸乙酯提取体积为5.0 mL、提取次数分别为1、2、3次。结果如表1所示,随着提取次数的增加,提取效率增加,提取次数为2和3时结果相差不大。同时考察了用10 ml乙酸乙酯提取1次的提取效率,结果显示加标回收率低于80%,综合考虑溶剂用量和提取效率,确定乙酸乙酯提取体积为5 ml,提取次数为2次。

表 1 提取次数对加标回收率的影响

2.3 方法学考察

2.3.1线性范围、检出限与定量线

取系列标准工作液,按优化的条件进样,以丙酸的峰面积为纵坐标(y)、质量浓度(x, mg/L)为横坐标绘制标准曲线。结果显示,丙酸在2～1 000 mg/L范围内呈现良好的线性关系,线性方程为y=0.807x+0.480,相关系数R=0.999 8。采用空白样品中添加目标物的方法,以3倍和10倍信噪比(S/N)分别计算方法的检出限(LOD)和定量线(LOQ),丙酸的LOD为0.003 g/kg, LOQ为0.01 g/kg。

2.3.2方法的回收率与精密度

按照1.5节和1.2节的方法分析检测9种阴性样品,加标水平分别为0.01、0.10和2.50 g/kg,每个加标水平平行测试6次。由表2和表3可知,脱脂提取法中丙酸的回收率为87.5%～97.6%,相对标准偏差为3.09%～6.86%;直接提取法中丙酸的平均回收率为90.1%～102.1%,相对标准偏差为3.32%～6.33%。

表 2 桃酥、饼干、面包、月饼和元宵样品丙酸的加标回收率和相对标准偏差(n=6)

表 3 酱油、醋、豆浆和豆腐乳样品中的加标回收率和

2.4 方法对比

2.4.1与国标方法的对比

如表4所示，取酱油、醋、面包和豆腐乳4种样品,采用本方法和GB 5009.120-2016中水蒸气蒸馏法对样品中丙酸的测定值和加标回收率进行比较。本方法加标回收率在95%以上,相对标准偏差小于5%,而国标蒸馏法的回收率多在90%左右。同时本方法快捷方便,可操纵性强,适用于大批量操作,并提高了方法的准确度和灵敏度。

表 4 GB 5009.120-2016(GB)与本方法在检测实际样品中丙酸结果的比较

ND: not detected.

2.4.2与文献方法的对比

将本方法与文献[4,17-20]方法进行比较,结果见表5。本方法针对含油脂和不含油脂的食品,分别建立了脱脂提取法和直接提取法,样品用量少,操作简单,适用于食品中丙酸及其丙酸盐的测定。

表 5 本方法与文献报道的方法中提取方法、样品用量、pH、加标回收率和检出限的比较

3 结论

建立了气相色谱测定食品中丙酸的方法,针对含油脂和不含油脂的食品,分别建立了前处理方法。本方法提高了丙酸的提取和检测效率,方法简便、快速、可靠,可用于食品中丙酸含量的测定。