尾矿区砷污染土壤的植物、微生物协同修复

李秀玲，韦岩松，辛 磊，高宇星，韦诗琪，覃拥灵

(河池学院 化学与生物工程学院，广西 宜州 546300)

污染土壤的重金属主要是镉、镍、铜、砷、汞、铅[1]。砷是一种有毒且致癌的化学元素，分布非常广泛，土壤中的砷主要来源于农业和工业[2-5]。砷在土壤中具有隐蔽性、累积性、不可逆性和长期性等特点[6-7]，土壤的砷污染修复十分必要。

以往对砷污染土壤的处理方法是改变耕作方式、水洗土壤或添加拮抗剂、改良剂等[6]。这些方法虽有一定作用，但存在二次污染隐患，且工程量大，耗时费力，难以从根本上消除砷的危害[8-9]。生态修复技术克服了以上缺陷，已成为研究热点和难点[10]。植物-微生物协同修复技术是目前最有发展潜力的一种生物修复技术[11]，可充分发挥植物与微生物的各自优势，取长补短，提高污染土壤修复效率，杜绝二次污染[12]。近年来，国内外学者对砷污染的植物、微生物联合修复技术进行了研究，已获得大量研究成果[13]，但所研究的植物主要是蜈蚣草，对风车草的研究则鲜有报道。

从长年开发的尾矿区取样，筛选出对砷具有超富集能力的优势植株风车草、蜈蚣草及砷耐受性较强的菌株CP3和CP7。利用筛选出来的菌株对砷富集能力最强的风车草在实验室进行盆栽试验，考察植物、微生物联合修复技术对去除砷污染的效果，以期为矿区砷污染的生态修复提供参考。

1 试验部分

1.1 试验材料及设备

试验所需植株、土壤样品均采自广西河池某尾矿区。

试验所用试剂：硝酸，盐酸，高氯酸，硫脲，抗坏血酸，硼氢化钾，氢氧化钠，砷标准溶液，均为分析纯；蛋白胨，酵母浸膏粉，琼脂，均为生化试剂。

试验所用设备：原子荧光光度计(AFS-99型)，电子天平(JA2003型)，超纯水机，pH计(PHS-3C型)，粉碎机，恒温箱(DHG-9245A型)，数控超声波清洗器(KQ-250DE型)。

1.2 试验方法

1.2.1重金属砷超富集植株的筛选

1)植物及其根际土壤样品的采集。从尾矿区选取长势良好的草本植物，连根带土一并挖起，共13种：鬼针草(Bidens pilosa L.)，南艾蒿(Artemisia verlotorum Lamotte)，藜(Chenopodium album L.)，苦荬菜(Ixeris sonchifolia Hance)，藿香蓟(Ageratum conyzoides L.)，木芙蓉(Hibiscus mutabilis Linn)，砖子苗(Mariscus sumatrensis)，大叶醉鱼草(Buddleja davidii Franch.)，蜈蚣草(Eremochloa ciliaris(Linn.) Merr.)，苎麻(Boehmeria nivea(L.) Gaudich.)，风车草(Cyperus alternifolius L.subsp.flabelliformis(Rottb.)KüKenth.)，灯芯草(Juncus effusus L.)，飘拂草属(Fimbristylis Vahl)，每种植物选取株高相近的3株作为平行样。取相应植物根际的土壤作为土壤样品。

2)土壤及植物样品的预处理。将土壤样品于阴凉干燥处风干，挑去其中的石子，放入研钵中磨碎，过0.15 mm筛。将过筛后的样品放入50 ℃烘箱中烘干一段时间后取出，放入干燥器中备用。

将植物样品清洗干净，晾干，测量其株高和质量(鲜)；然后放进50 ℃烘箱中，累积烘干48 h，再分别测定植株根部和地上部分质量(干)。对植株的根部和地上部分分别破碎，分开标记、保存，备用。

3)土壤pH的测定。称取通过1.00 mm尼龙筛的风干研磨后的土壤样品10 g放入50 mL烧杯中，加入去离子水25 mL，搅拌静置30 min后，用pH计测定土壤pH。每个样品重复3次，结果取平均值。

4)土壤及植物样品的消解。称取一定质量样品加入聚四氟乙烯消解管中，加少量水润湿，加16 mL硝酸、4 mL高氯酸，盖上盖子，摇匀，放置24 h后置于消解仪中加热1 h，去掉盖子继续加热。如试样体积减小，或试样发黑，则补加2 mL硝酸继续加热。温度控制在200 ℃以下(超过200 ℃样品会有损失)，直至管内残余灰白色残渣，取下冷却，用1 mL 50%硝酸溶解残渣，并转移到50 mL比色管中，用超纯水清洗，最后用超纯水定容。

5)土壤与植物样品中砷的测定。采用原子荧光光度法[14]测定土壤及植物样品中砷质量分数。测定条件：负高压300 V；总灯电流50 mA，主辅阴极各25 mA；原子化器高度8 mm；载气300 mL/min，屏蔽气900 mL/min。加入还原剂砷标准溶液和样品溶液后静置30 min左右，保证砷在反应前已被还原成正三价。

6)植物体内砷迁移率和富集率计算。

1.2.2砷富集微生物的筛选

1)初筛。取砷质量分数最高的植物根际土壤作为筛选微生物土壤样品。从该土壤样品中分离的微生物对砷的耐受性较好。

取10 g土壤样品加入到含有玻璃珠的90 mL无菌水中，漩涡振荡器振荡摇匀，再分别取1 mL加入到无菌水中，依次稀释成质量浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8g/mL土壤悬浊液。取质量浓度为10-6、10-7、10-8g/mL的土壤悬浊液各200 μL涂布于LB固体培养基上，每个梯度设3次重复，置于37 ℃培养箱中培养，待菌落长出后挑取外形明显不同的单菌落划线培养，备用。

2)复筛。将初筛得到的细菌接种到LB液体培养基中，于37 ℃、180 r/min条件下培养12 h，用灭菌后的离心管在10 000 r/min速度下离心后，倒掉上清液，控干水分，菌体备用。

配制砷质量浓度为5 mg/L的LB液体培养基，每瓶装液体积100 mL，灭菌后，在超净台中称取菌体1 g加入到培养基中，每个菌株重复3次，以不加菌体的含砷LB培养基作为对照，于37 ℃、180 r/min条件下培养12 h后，在10 000 r/min速度下离心，利用原子荧光光度法测定上清液中砷质量浓度。

1.2.3植物、微生物协同修复砷的效果

1)砷富集微生物的培养。将复筛得到的砷富集菌株CP3、CP7接种到含100 mL LB液体培养基的三角瓶中，在37 ℃、180 r/min条件下培养12 h，之后用LB液体培养基分别将单菌株及2个菌株混合液调整至含菌量相等，备用。

2)温室盆栽试验。盆栽试验在温室大棚中进行。供试风车草购自河池当地花卉市场，植株长势一致。供试土壤采自未遭受重金属污染的公园，经风干破碎过3 mm筛，混匀后按每盆1 kg土加入到12个花盆(上口直径15 cm，下口直径10 cm，高10 cm)中，每盆各种植1株风车草，加入50 mL配好的营养液，缓苗7 d，之后向每个花盆中加入一定体积砷标准溶液(质量浓度 1 mg/mL)，使盆栽土砷质量分数为5 mg/kg，然后加水保持湿润(加水量保持在田间持水量的60%)，平衡7 d。将调整好的CP3、CP7及二者混合菌液各20 mL加入到风车草根部，每组重复3次，以不加菌的风车草为对照，记为ACK。每2 d浇水1次，保持含水量，10 d后加1次营养液。

60 d后，将风车草整株取下，洗净，用5 mmol/L硝酸钙溶液浸泡根部15 min,之后用去离子水洗净，杀青、烘干，测定风车草的生物量、株高及砷质量分数。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 2007和SPSS20.0软件进行统计分析。每个样品均重复3次，结果取平均值。选用最小显著性差异法进行多重比较的方差分析(α=0.05)。

2 试验结果与讨论

2.1 尾矿区优势植物生物量及根际土壤pH的测定

尾矿区13种优势植物样品生物量及根际土壤pH的测定结果见表1。

表1 13种优势植物样品生物量及根际土壤pH测定结果

由表1看出：尾矿区分布的各种优势植物的长势区别较明显;其中，藿香蓟、木芙蓉、蜈蚣草3种植物质量(鲜)均低于20 g，说明这3种植物的生物量相对较低，但并不能说明它们对砷的富集效果一定低于其他植物，还需进一步验证；尾矿区13种优势植株的根际土壤几乎都呈弱酸性，会使土壤中的重金属离子处于活性状态，很容易被植物体吸收和转化。这对研究植物对重金属的富集效果非常有利。

2.2 尾矿区优势植株及其根际土壤砷质量分数的测定

尾矿区优势植株及其根际土壤砷质量分数测定结果见表2。

表2 尾矿区优势植株及其根际土壤砷质量分数

由表2看出:尾矿区13种植物及其根际土壤的砷质量分数差别较大;鬼针草、藜、苦荬菜、蜈蚣草、风车草、灯芯草6种植物的地上部分的砷质量分数均高于其对应地下部分根系中的砷质量分数，说明这6种植物对砷有一定迁移转化能力，能将砷从土壤中转移至植物地上部分，通过收割植物方式可以将砷从土壤中分离去除。

2.3 植物对砷的迁移率和富集率

植物、微生物联合修复重金属污染土壤是今后重金属修复领域研究的重点和热点[15]。微生物在结合重金属的同时还产生一些有机酸、生长素等物质，可促进植物对重金属的吸收、累积及植物生长[16]。13种优势植物样品对砷的迁移率和富集率计算结果如图1所示。

图1 植物样品对砷的迁移率和富集率

由图1看出：具有较高迁移率、富集率的只有蜈蚣草和风车草；风车草的迁移率和富集率均优于蜈蚣草，富集率高达589%，迁移率高达67%。蜈蚣草对砷的吸附效果已有研究[17-18]。风车草适应性强，生长旺盛且株形较大，虽在水土保持方面有较好的应用[19]，但对砷的吸附研究尚未见有报道：因此，选择风车草进行盆栽试验。

2.4 砷富集微生物初筛

经过初筛，共得到外形明显不同的细菌10株，分别标记为CP1～CP10。不加菌体的含砷LB培养基为对照，记为CK。将这10株菌株挑取单菌落，纯化培养，为下一步试验做准备。

2.5 砷富集微生物复筛

上清液中的砷质量浓度测定结果见表3。可以看出，10株菌株对砷均具有一定富集能力，其中，CP3和CP7菌株对砷的富集能力更强。这是因为：在液体中，菌体表面含有多种极性官能团，可以提供吸附活性位点，这些活性位点与砷离子结合[20]；而且，死菌也可以通过细胞壁表面的一些化学基团吸附重金属[21]。微生物对砷除具有富集作用之外还具有转化功能，利用本身的氧化还原能力和甲基化作用可将砷转化为低毒形态，以此促进植物对砷的吸收[22]，因此，选取这2株菌进行盆栽试验，并通过植物-微生物的协同作用考察对砷的富集效果。

表3 上清液中的砷质量浓度测定结果

注：数据中的不同字母代表存在显著性差异(P<0.05)。

2.6 盆栽试验结果

2.6.1风车草的生物量

风车草试验前后的生物量测定结果见表4。可以看出：经过培养，风车草的株高和质量(鲜)均有所增加，表明风车草在设定的培养环境中能够生长；添加菌株的试验组株高和质量(鲜)均高于对照组，添加复合菌的试验组株高和质量(鲜)分别比对照组的高57.80%和46.51%，表明添加菌株尤其是复合菌株有助于风车草生长。微生物的代谢活动在一定程度上可改善土壤理化性质，产生一些生长素类物质，促进植物生长。

表4 风车草试验前后的生物量测定结果

2.6.2风车草中的砷质量分数

风车草中的砷质量分数及迁移率、富集率测定结果见表5。可以看出，经过一段时间生长，土壤中所加入的砷一部分被风车草吸收，加入菌的试验组砷迁移率提高21.08%，富集率提高64.87%，表明加入菌株更有利于风车草对砷的迁移和富集。微生物的代谢活动在一定程度上可改善土壤的理化性质，促进植物对土壤中重金属的吸收和累积，提高土壤修复效率。

表5 风车草中的砷质量分数及砷迁移率、富集率测定结果

注：同一列数据中的不同字母代表存在显著性差异(P<0.05)。

3 结论

研究结果表明，矿区周边长势良好的风车草加复合菌对砷的富集和迁移有较好效果，可以有效降低土壤中砷质量分数。实验室盆栽试验结果表明，添加复合菌，植物长势良好，未出现重金属毒害现象，其对砷的富集率和迁移率明显提高，这证实复合菌有助于风车草对砷的富集和迁移。在对砷的分离去除过程中，微生物和植物可共同发挥作用。