冷浸渍过程中真核微生物与小芒森干白葡萄酒香气成分的变化

杨 沫,刘 文,赵新节

(齐鲁工业大学,山东省微生物工程重点实验室,山东济南 250300)

小芒森(Petit Manseng),又称小满胜、佩特蒙森,起源于法国阿奎坦南部比利牛斯大西洋省,果实皮较厚,颗粒较小,果穗松散,因此即使采收期较晚也不易感染病菌,其糖高达260～280 g/L,酸低至9～11 g/L,糖高酸低,更适于酿造优质的甜白葡萄酒,入口圆润,香气浓郁,层次感和平衡性出色。冷浸渍一般是指为了浸提果皮中的芳香物质,获得更加优雅浓郁的香气,对除梗破碎后的葡萄原料在一定低温条件下浸渍的一种酿造工艺[1]。因此冷浸渍工艺不仅能增加葡萄酒色度、色调、花色苷等酚类物质的含量[2],对香气物质含量更是有着直接影响。葡萄酒的香气质量主要取决于酯醇等化合物的浓度及种类[3],而这些又受酵母种类、葡萄品种及发酵条件等的影响[4-6]。因此冷浸渍过程中对于葡萄酒最终品质的影响不仅有物理作用还有微生物的作用,尤其是自然条件下附着于小芒森葡萄表面的野生酵母,与葡萄果实上的真核微生物在低温条件下的微弱的代谢有关。但是国内研究冷浸渍条件下真核微生物尤其野生酵母以及小芒森葡萄酒香气成分变化的报道较少。徐亚男等[7]将非酿酒酵母菌株和工业菌株混合发酵赤霞珠葡萄酒,对香气成分进行分析,但是对不同非酿酒酵母的特征香气没有确切的研究;何娟等对贵人香冰酒大生产过程中酵母菌群结构及动态变化进行了研究分析,发现了几株非酿酒酵母,但是对其存在的机理及环境尚不明确[8]。本实验主要探究在冷浸渍过程中小芒森表皮真核微生物丰度及多样性的变化以及风味物质的变化,以期为优化小芒森葡萄酒酿造工艺提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小芒森 2016年10月17日采摘于烟台蓬莱中粮长城有限公司;酿酒酵母(EC1118)、EX果胶酶 法国Lallemand公司;亚硫酸、4-甲基2-戊醇、3,5-二硝基水杨酸、糖度计、酒精计 天津市科密欧化学试剂有限公司;四甲基二戊醇 美国Aldrich公司。

自动固相微萃取进样器、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头、7890B气相色谱-5977A型质谱联用仪 美国Supelco公司;5L玻璃发酵罐 四川蜀玻有限公司;DB-WAX毛细管柱 美国J&W公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小芒森干白葡萄酒酿造工艺 将10 kg小芒森葡萄(19 °Brix)除梗破碎,葡萄醪放置恒温箱并且控制温度4 ℃,分别带皮浸渍1、3、5 d,每个处理浸渍结束后取样(三个处理以下均用F1、F2、F3表示),浸渍结束后的葡萄醪进行压榨(皮渣分离),将分离的葡萄汁澄清24 h,按照60 mg/L添加亚硫酸,添加酵母(0.25 g/L)后于18～20 ℃发酵,约15 d后发酵结束后澄清,取样待测香气物质。

1.2.2 基本指标测定方法 葡萄酒基本成分理化指标检测严格按照国家标准GB/T15038-2006葡萄酒、果酒通用分析方法》中的方法进行检测。主要包括糖度、酒精度、总酸、还原糖、挥发酸等指标。糖度使用糖度计测定;酒精度使用酒精计测定;总酸采用电位滴定法测定;还原糖采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定；挥发酸采用蒸馏-滴定法测定。

1.2.3 微生物分析 对冷浸渍1、3、5 d分别取样50 mL,送华大基因检测样品中真核微生物含野生酵母菌、真菌、霉菌等的种类及丰度(DNA样品被接收后,对样品进行检测;检测合格的样品构建文库:回收目的Amplicon片段,用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK将打断形成的粘性末端修复成平末端,再通过3′ 端加碱基“A”,使得DNA片段能与3′ 端带有“T”碱基的特殊接头连接;或者设计合成含有测序接头的双Index融合引物,以基因组DNA为模板,进行融合引物PCR,磁珠筛选目的Amplicon片段,最后,用合格的文库进行cluster制备和测序)。

1.2.4 挥发性成分分析 发酵结束后的葡萄酒样品用顶空固相微萃取(Headspace-solid-phase-microextraction HS-SPME)方法预处理[9],萃取头为 50/30 μmDVB/CAR/PDMS(Supelco)。用移液器取 4990 μL样品放入15 mL萃取瓶中,加入20 μL 4-甲基2-戊醇做为内标,加入2 g氯化钠。萃取瓶置于固相微萃取工作台上,35 ℃预热10 min,磁力搅拌速度为100 r/min。将固相微萃针插入萃取瓶,推出萃取头顶空萃取30 min。当样品萃取达到平衡后,缩回萃取头,迅速将萃取针插入气相色谱仪的进样口,推出萃取头同时启动气相色谱仪采集数据,高温解析5 min后将萃取头缩回,拔出。色谱柱升温程序如下:40 ℃保持8 min,以5 ℃/min升至70 ℃,保持3 min。以5 ℃/min升至230 ℃,保持2 min。进样器250 ℃,检测器220 ℃,无分流进样。EI离子轰击,电子能量70 eV;离子源温度200 ℃;全扫描模式。

1.2.5 挥发性成分的定性与定量分析 定性分析:分析结果运用计算机谱库(NIST11)进行初步检索和分析,再结合文献进行人工谱图解析,确定挥发性物质的各个化学成分。定量分析:采用内标法进行定量分析,计算结果为两年的平均值。计算公式如下:香气各组分的含量(μg·g)=[各组分的峰面积/内标的峰面积×内标浓度(μg·m L)×1000]/样品量(g)

1.2.6 数据处理 采用SPSS 19.0进行数据分析,多组间比较采用One-WayANOVA法。

2 结果与分析

2.1 冷浸渍时间对小芒森葡萄酒基本指标的影响

小芒森冷浸渍1、3、5 d处理发酵结束后葡萄酒基本指标如表1所示。与冷浸渍1 d与冷浸渍3 d相比,冷浸渍5 d的小芒森葡萄酒的酒精度最高,为16.00 °。冷浸渍3 d的小芒森葡萄酒中的总酸含量及还原糖含量均比冷浸渍1 d和5 d的总酸含量和还原糖含量要高。可以看出,冷浸渍1 d的小芒森葡萄酒中挥发酸含量比冷浸渍3 d和冷浸渍5 d的要高。葡萄酒的基本指标没有一定的变化规律,且对于葡萄酒来讲,以上葡萄酒基本指标的微小变化对酒体没有影响,因此说明冷浸渍时间对葡萄酒基本指标没有明显影响。

表1 不同冷浸渍时间条件下小芒森葡萄酒基本指标Table 1 Basic indicators of Xiaomiansen wine under different cold immersing time conditions

2.2 冷浸渍时间对果浆中微生物的影响

如表2,其中,Alpha多样性(Alpha diversity)是对单个样品中物种多样性的分析[10],包括Sobs(observed species)指数、chao指数、ace指数,shannon指数以及simpson指数等,其中simpson指数最小,说明样品中的物种越丰富。其中,Sobs指数、chao指数和ace指数反映样品中群落的丰富度shannon(species richness),即简单指群落中物种的数量,而不考虑群落中每个物种的丰度情况。

表2 样品Alpha多样性统计结果Table 2 Sample Alpha diversity statistics

根据表2中样品Alpha多样性统计结果分析,冷浸渍1、3、5 d过程中,随着冷浸渍时间的增加,Sobs指数呈增加趋势,chao指数及ace指数呈先减少后增加趋势,shannon指数呈增加趋势,simpson指数呈减小趋势。因此综合分析,shannon指数的增加、simpson指数的减小,说明真核微生物物种分类及丰度的变化趋势为逐渐增加的趋势,F1到F2增加不明显,F3中真核微生物的物种数量最高。

2.3 冷浸渍时间对小芒森葡萄酒中的挥发性物质的影响

如表3可知,小芒森干白葡萄酒F1中共检测出77种,其中包括21种醇类化合物,33种酯类化合物,11种酸类化合物,以及醛酮类、苯类等其他化合物共15种;F2中共检测出78种挥发性物质,其中包括18种醇类化合物,36种酯类化合物,9种酸类化合物,以及15种醛酮类、苯类等其他化合物;F3中共检测出86种挥发性物质,其中包括20种醇类化合物,41种酯类化合物,9种酸类化合物,以及醛酮类、苯类等其他化合物共16种。冷浸渍1、3、5 d处理中,葡萄酒中香气物质总含量分别348.74、345.31、402.5 mg/L。F3中香气物质总含量最高,其中醇类、酯类化合物含量是三个处理中最高,为酒体带来浓郁花香果香。F1、F2、F3中含量最高的醇类、酯类、酸类、醛酮类化合物分别为异戊醇、苯乙醇、辛酸乙酯、葵酸乙酯、己酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸和二异丁基酮。

表3 不同冷浸渍时间条件下小芒森干白葡萄酒中挥发性物质组成及含量(mg/L)Table 3 The composition and the concentrations of the volatile compounds in Petit Manseng dry white wine under different cold maceration time conditions(mg/L)

续表

续表

异戊醇具有溶剂味、指甲油味、酒精味[11];苯乙醇具有玫瑰花香、蜜香;辛酸乙酯具有怡人的香蕉、梨的果香气味;葵酸乙酯具有梨果香气;己酸乙酯具有香蕉味及青苹果香气[12];乙酸异戊酯具有香蕉等果香;辛酸具有奶酪略粗涩的气味[13];二异丁基酮具有果香及薄荷气味[14]。因此以上物质给予酒体浓郁的花香果香蜜香,其次是略微的草本及脂肪香气,使得酒体香气更加丰满有层次。

本实验中三个处理香气物质的变化趋势是在第5 d达到最高,尤其是对酒体花香果香作出重要贡献的醇类和酯类物质在第5 d处理中含量最高。葡萄酒中的香气有不同的来源,高级醇、酯和酸等主要香气物质[15-16]属于发酵香气,是发酵过程中微生物产生的。冷浸渍过程中存在着葡萄果实上自带的大量真核微生物,它们生理活动也会对醇类、酯类挥发性化合物产生直接影响。真核微生物中不仅有各种真菌,还有多种野生酵母对葡萄酒的香气都有着重要贡献。有研究表明,自然发酵过程中,葡萄表皮附着的真核微生物中的一些非酿酒酵母属及其他种属的酵母均对葡萄酒香气物质的多样性和含量的形成具有积极作用[17-18]。

Alpha多样性统计结果分析,样品中真核微生物物种数量的变化趋势为逐渐增加的趋势,与F1相比,F2中真核微生物含量略高,F3中明显高出很多,冷浸渍过程中微生物的丰度及多样性对香气物质的数量及总量产生影响。在低温浸渍下F1、F2中真核微生物在前三天处于延滞期,又称为调整期或适应期,因代谢系统适应新环境的需要,物种数量没有明显增加[20],又由于醇类物质挥发性较强,如图1所示F1到F2过程中醇类挥发性物质含量有所下降。F2到F3中的醇类物质含量又有所增加,这一时期醇类化合物中含量变化较大的有异戊醇、(2R,3R)-(-)-2,3-丁二醇、苯乙醇,这可能是由于真核微生物处于快速生长期,较低的浸渍温度刺激了野生酵母的繁殖合成高级醇所致[19]。酯类物质的合成受酶的调控,不同酵母菌株酯酶含量不同,则产酯的能力不同[19]。刘峻溪在其野生酵母和商品酵母发酵葡萄酒中挥发性成分差异研究中得出结论,野生酵母会产生更高的脂肪酸乙酯[20-21]。经计算得出,F1、F2、F3中脂肪酸乙酯的总含量分别为187.87、199.29、222.07 mg/L,其中己酸乙酯、2-己烯酸乙酯、5-己烯酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、棕榈酸乙酯(脂肪气味)表现最明显,在F1到F3中均呈逐渐增加的趋势,F1到F2中呈微量增加,F2到F3中增加较明显,样品中真核微生物物种数量变化同样呈增加趋势。浸渍时间的延长使F3中脂肪酸乙酯含量增加,增强了的葡萄酒中的果香味。

图1 小芒森F1、F2、F3处理中不同种类香气物质的种类及含量Fig.1 The types and contents of different kinds of aroma compounds in the treatment of F1,F2 and F3

3 结论与讨论

在F1、F2、F3过程中,真核微生物呈逐渐增加趋势,香气物质总含量总体呈增加趋势,醇类物质由于其挥发性较强,其含量呈先减少后增加趋势,酯类物质较稳定呈逐渐增加趋势,尤其脂肪酸乙酯表现最为明显,在物理及微生物的作用下F3香气物质总含量最高,因此冷浸渍五天酿造的葡萄酒更加香气浓郁、具有层次感。本实验只对冷浸渍过程中真核微生物丰度变化及小芒森整体香气物质的变化做出了初步探究,微生物是否对香气物质产生影响以及具体是哪种微生物或是其中哪种酵母(包括酿酒酵母和非酿酒酵母)对何种香气物质产生影响尚需要研究。