桑葚籽黄酮超声酶解提取工艺优化及其抗菌、抗氧化活性

曹培杰,崔 晋,马艳弘

(1.山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷 030901;2.江苏省农业科学院农产品加工研究所,江苏南京 210014)

桑葚又名桑葚子、桑果、桑子,是荨麻目桑科植物桑树(MorusalbaL.)的果实,含花青素、必需氨基酸、白藜芦醇、维生素及多种微量元素,为卫生部首批药食两用的果品之一,具有抗菌[1-3]、抗衰老、抗肿瘤、降低胆固醇、提高免疫力等保健功能,在临床上已用于慢性肝炎、高血压、高血脂、糖尿病、再生障碍性贫血、胃肠道疾病、老年便秘和睡眠障碍的辅助治疗[4-7],其相关产业发展已受到社会各界的广泛关注,深加工产品在国内外市场备受青睐。桑葚果中含有丰富的营养成分,国内的加工产品有桑葚果酱、果汁饮料、桑葚果酒、桑葚果醋等。但是这些产品加工后的副产物(桑葚籽),目前仅仅用于饲料,还没有引起农民及科学家们的充分关注与重视。

桑葚籽为桑葚果酒、果汁等产品的加工废弃物,富含黄酮、多糖、生物碱、二苯乙烯类等活性成分[8],具有很强的生物保健功能和良好的开发应用前景。目前,有关桑葚的研究主要集中在果实花色苷、膳食纤维、多糖等方面,而关桑葚籽黄酮的提取和生物活性研究仍未见报道。桑葚籽中的黄酮,是一类对机体生命活动及其重要的次生代谢产物,此类次生代谢产物是多酚类化合物,化合物分子式中具有苯—吡喃酮的结构官能团。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类,小部分以游离态(苷元)的形式存在[9-13]。本研究采用复合酶超声辅助提取法提取桑葚籽黄酮,考察果胶酶和纤维素酶的添加量、复合酶比例、酶解温度、酶解时间、pH、超声时间对黄酮得率的影响,并在单因素试验基础上,通过响应面分析法优化桑葚籽黄酮的提取工艺,进一步研究其抗氧化活性与抑菌活性。采用超声波酶法辅助提取桑葚籽黄酮,因为植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶,恰当地用酶处理,可使细胞壁发生不同程度的改变,从而改变细胞壁的通透性,提高黄酮类化合物的得率,而且提取速度快、效率高、对黄酮活性的破坏小，可为进一步的工业化生产提供可靠的技术参数[14];以桑葚籽为原料提取黄酮类物质,极大地提高了桑葚资源的利用率,为桑葚加工副产物的高值化利用提供了新的技术途径。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桑葚籽 句容万山红遍生物科技有限公司;沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和酵母菌 江苏省农科院加工所提供;DPPH、芦丁、槲皮素、HPD300大孔树脂 上海源叶生物科技有限公司;羟自由基测定试剂盒、抗超氧阴离子自由基测试盒 南京建成生物工程研究所;其他试剂均为国产分析纯。

DXF-04D小型高速打粉机 广州市大祥电子机械设备有限公司;HWS-11恒温水浴锅 上海善志仪器设备有限公司;TGL-16B台式离心机 上海安亭科学仪器厂;D-B5型紫外可见分光光度计 上海奥析科学仪器有限公司;RE-600A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;Epoch全自动酶标仪 Bio Tek公司;ZD-F12真空冷冻干燥机 SANYO公司;SCIENTZ-IID超声波细胞破碎机 宁波新芝生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理 将桑葚籽清洗干净,平铺于桌面上,过夜,沥干多余的水分,在60 ℃恒温干燥箱中干燥6 h,烘至恒重,粉碎,过60目筛,得桑葚籽粉。取30 g桑葚籽粉,用滤纸包好后,置于抽提器中,加入150 mL石油醚于60 ℃水浴下脱脂6 h,取出滤纸包,置于60 ℃烘箱中放置2 h,得到脱脂桑葚籽粉,4 ℃冷光保存备用。

1.2.2 桑葚籽黄酮的提取 采用超声复合酶法提取[14-15]。取1.0 g脱脂桑葚籽粉,按照1∶20 (g/mL)固液比加入体积分数为70%的乙醇溶液,用0.5 mol/L的NaOH溶液调节至一定pH,再加入果胶酶或纤维素酶(通过单因素实验确定其适合的比例),混合均匀,然后在一定温度下酶解一定时间。酶解结束后置于超声波细胞破碎机中,超声功率300 W下处理一定时间,室温下,3500 r/min离心15 min,取上清液,滤渣再重复提取1次。合并两次滤液,并通过旋转蒸发仪(浓缩温度为45 ℃,压力为0.1 MPa)进行减压浓缩,1 h后,得到桑葚籽黄酮粗提液,再经大孔树脂分离纯化、减压浓缩(条件同上)，通过冷冻干燥机-50 ℃条件下冷冻12 h,得到桑葚籽黄酮提取物。

1.2.3 黄酮含量的测定 以芦丁为标准品制作标准曲线[16]。将20 mg芦丁标品用体积分数为95%的乙醇溶解,制成0.20 mg/mL的芦丁标准品溶液。分别移取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL的上述溶液至10 mL容量瓶中,加入质量分数为5% NaNO2溶液0.5 mL,摇匀后静置6 min;再加入10% Al(NO3)3溶液0.5 mL,摇匀,静置6 min;继续加入质量分数为4% NaOH溶液4.0 mL,定容,摇匀后放置10 min,扫描得到最大吸收波长为510 nm。在此波长处测吸光度,以黄酮质量浓度(以芦丁计)为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制得到黄酮的标准曲线回归方程为:y=9.74x-0.0053,式中:x为黄酮质量浓度(以芦丁计)(mg/mL);y为所对应的吸光度;相关系数R2=0.9994。取桑葚籽黄酮提取液1.0 mL,据标准曲线的制作方法测定510 nm处的吸光度,根据回归方程算出黄酮的质量浓度,再按照公式(1)计算黄酮得率:

黄酮得率(mg/g)=C×V×n/m

式(1)

式中:C为由标准曲线计算出的黄酮质量浓度(mg/mL);V为提取液总体积mL;n为稀释倍数;m为脱脂桑葚籽粉的质量g。

1.2.4 桑葚籽黄酮提取的单因素实验

1.2.4.1 酶添加量对桑葚籽黄酮得率的影响 准确称取脱脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,调节pH至6.0,分别加入不同量的(0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL)果胶酶和纤维素酶,混合均匀,然后在55 ℃条件下酶解90 min,酶解结束后置于超声波细胞破碎机中,超声功率300 W下处理20 min,室温下,3500 r/min离心15 min,取上清液,滤渣再重复提取1次。合并两次滤液,并通过旋转蒸发仪(浓缩温度为45 ℃,压力为0.1 MPa)进行减压浓缩,1 h后,得到桑葚籽黄酮粗提液,按照1.2.3的方法测定黄酮含量。

1.2.4.2 复合酶比例对桑葚籽黄铜得率的影响 准确称取脱脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,调节pH至6.0,按不同比例(1∶1、1∶2、2∶1)加入果胶酶和纤维素酶,混合均匀,以下步骤同1.2.4.1。

1.2.4.3 酶解温度对桑葚籽黄酮得率的影响 准确称取脱脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,调节pH至6.0,按照果胶酶与纤维素酶比例为2∶1添加复合酶0.3 mg/mL,分别在不同温度下(30、35、40、45、50、55、60 ℃)酶解90 min,以下步骤同1.2.4.1。

1.2.4.4 酶解时间对桑葚籽黄酮得率的影响 准确称取脱脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,调节pH至6.0,按照果胶酶与纤维素酶比例为2∶1添加复合酶0.3 mg/mL,在55 ℃条件下酶解不同时间(20、40、60、80、100、120 min),以下步骤同1.2.4.1。

1.2.4.5 pH对桑葚籽黄酮得率的影响 准确称取脱脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,分别调节pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0,按照果胶酶与纤维素酶比例为2∶1添加复合酶0.3 mg/mL,在55 ℃条件下酶解80 min,以下步骤同1.2.4.1。

1.2.4.6 超声时间对桑葚籽黄酮得率的影响 准确称取脱脂桑葚籽粉1.0 g,按照1∶20加入70%的乙醇溶液,调节pH至6.0,按照果胶酶与纤维素酶比例为2∶1添加复合酶0.3 mg/mL,在55 ℃条件下酶解80 min,然后置于超声波细胞破碎机中处理不同时间(5、10、15、20、25、30 min),以下步骤同1.2.4.1。

1.2.5 桑葚籽黄酮提取的响应面优化试验 在单因素实验基础上,以2∶1的果胶酶和纤维素酶组成的复合酶的添加量(X1)、酶解温度(X2)、酶解时间(X3)、超声时间(X4)为试验因素,采用 Box-Behnken响应面法优化桑葚籽黄酮的提取工艺条件[17]。试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验分析因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 黄酮的抗氧化活性测定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力测定 取冻干后的桑葚籽黄酮粉末,配制成5.0 mg/mL的总黄酮溶液,并用70%乙醇稀释成不同浓度(0.05、0.20、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL),分别移取0.1 mL稀释液至96孔板中,每个浓度做三次平行,分别加入0.05 mg/mL DPPH溶液0.1 mL,混匀,于室温下避光放置30 min,在517 nm处测吸光度A;对照组用0.1 ml 70%乙醇代替DPPH溶液,测其吸光度A1;空白组用0.1 mL 70%乙醇代替样品,测其吸光度为A0,以同浓度的VC为对照[18-19],按照公式(2)计算DPPH自由基清除率:

式(2)

1.2.6.2 羟自由基抑制能力测定 分别取不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL)的样品溶液,根据羟自由基测定试剂盒说明书进行测定,以双蒸水作为对照组，在550 nm处测吸光度,按照公式(3)通过计算羟自由基的清除率:

式(3)

1.2.6.3 抗超氧阴离子自由基能力测定 采用抗超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基测试试剂盒,测定桑葚籽黄酮抗超氧阴离子自由基活力。配制0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的桑葚籽黄酮溶液,按试剂盒说明书操作,以VC标准品对照，在550 nm处测其吸光度为OD标准组，双蒸水为空白对照，其吸光度为OD对照组。按照公式(4)计算超氧阴离子自由基清除能力:

式(4)

1.2.7 桑葚籽黄酮的抑菌实验

1.2.7.1 菌种活化 从-70 ℃冰箱中取出供试菌株,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和酵母菌,4 ℃条件下解冻,分别移取200 μL菌株接种于10 mL LB液体培养基中,置于37 ℃摇床中培养24 h,然后分别吸取100 μL于5 mL LB培养基中,进行二次传代。

1.2.7.2 抑菌活性测定 将配制好的LB琼脂培养基装入250 mL三角瓶中,121 ℃灭菌20 min,冷至50～60 ℃,倒入直径为9 cm的无菌培养皿中各15 mL,待其凝固后,取100 μL菌悬液均匀涂布在平板上,放入牛津杯,用移液器取不同浓度(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mg/mL)的黄酮提取液200 μL,加入牛津杯中,重复3次,以无菌水作对照[20],置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h,测定抑菌圈直径。

1.2.7.3 最小抑菌浓度(MIC)测定 将桑葚籽黄酮提取液加入50 ℃无菌LB琼脂培养基中,混合均匀,使其在培养基中的浓度分别为0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、3.00 mg/mL,然后倒入无菌培养皿中,凝固后,分别加入大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌菌悬液100 μL,涂布均匀[21],放入37 ℃培养箱中培养24 h,观察是否有肉眼可见菌落。

1.3 数据处理

实验进行3次重复操作，实验数据采用Origin 8.5软件进行处理并用图表Design-Expert 8.0.6进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

不同因素对桑葚籽黄酮得率的影响效果如图1所示。由图1a可以看出,果胶酶和纤维素酶对黄酮得率的影响有所不同,在一定添加范围内,随着酶用量的增大,黄酮的提取效果明显提高,果胶酶用量和纤维素用量为0.4 mg/mL时,黄酮得率均达到最高,分别为4.21和4.65 mg/g。继续增加酶的用量,黄酮提取效果保持平缓甚至降低。可能是过量的酶附着在桑葚籽粉表面而影响黄酮类化合物的溶出;也可能是酶与底物充分反应后,继续添加酶对黄酮溶出量影响不大。因此确定单一酶最佳浓度为0.4 mg/mL。

图1 不同因素对桑葚籽黄酮得率的影响Fig.1 Effects of different factors on the yield of flavonoids from mulberry seeds

由图1b可以看出,不同的复合酶浓度及比例对黄酮得率影响效果不同,当复合酶添加量为0.3 mg/mL,且果胶酶∶纤维素酶=2∶1时,黄酮得率最高,为5.16 mg/g,这是由于细胞壁由果胶和纤维素组成,果胶酶和纤维素酶以一定比例共同作用,能够更好地破坏细胞壁,释放出黄酮类物质。

由图1c可知,当温度低于55 ℃时,黄酮得率随温度的升高而增大,55 ℃时,黄酮得率达到峰值5.12 mg/g,当温度大于55 ℃后,黄酮得率呈下降趋势。继续升温反而会降低,表明当酶解温度低于55 ℃时,随着温度的升高,酶活性升高,黄酮分子热运动增强,所以得率也随之提高;但温度过高会使得酶蛋白变性,酶活性降低,还会使得一些醇溶性杂质快速溶解,干扰黄酮浸出速率,还有可能引起黄酮类物质结构被氧化破坏,从而导致黄酮得率降低。因此选择55 ℃为最佳酶解温度。

如图1d所示,随着酶解时间的延长,黄酮得率逐渐提高,当酶解时间为80 min时,黄酮得率达到4.97 mg/g。当酶解时间超过80 min后,黄酮得率趋于平缓。表明充足的提取时间可以使底物和酶充分接触,从而提高提取效率,但是当黄酮的溶出基本达到平衡后,即便延长时间,提取量也不会发生变化。因此,确定最佳提取时间为80 min。

如图1e所示,溶液的pH会影响酶的活性,在微酸性环境下,酶的活性较高。pH小于5.0时,随着pH的增大,黄酮提取率增加,当pH达到5.0时,黄酮得率达到最大值4.62 mg/g,随后逐渐降低。这是由于不适宜的pH能影响到酶的构象和底物的解离状态,从而导致酶活以及提取效率的降低。由此确定最佳pH为5.0。

如图1f所示,随着时间的延长,黄酮得率逐渐增加,20 min以后,黄酮得率逐渐趋于平缓,这是由于随着时间的延长,超声的机械振动和空化作用导致了桑葚籽细胞壁的破坏,被提取物的分子运动速度加快,从而导致了得率提高。但是超声时间过长可能会与氧气接触或杂质增多,从而导致黄酮得率变化不明显。因此选择20 min为最适超声时间。

2.2 响应面试验结果分析

表2 响应面设计及试验结果Table 2 Response surface design and experimental results

表3 方差分析表Table 3 The table of variance analysis

超声波酶法提取桑葚籽黄酮的等高线和响应面见图2～图5,等高线可直观地反映各因素对黄酮提取效果的交互作用程度,等高线呈圆形表示两因素交互作用不显著,而呈椭圆形则表示两因素交互作用显著[22-23]。响应曲面图中的曲面的陡峭程度可以表明变量对黄酮得率的影响程度,曲面较陡峭表明影响较大,反之则较小。复合酶添加量和酶解时间、复合酶添加量和酶解温度、酶解时间和酶解温度及超声时间和酶解时间的交互作用的等高线均呈现椭圆、扁平状,由此可知上述因素之间的相互作用显著。

图2 酶添加量和酶解温度交互作用的等高线和响应面图Fig.2 Contours and response surface plots of enzyme interactions and enzymatic temperature

图3 酶添加量和酶解时间交互作用的等高线和响应面图Fig.3 Contours and response surface plots of enzyme interactions and enzymolysis time

图4 酶解温度和酶解时间交互作用的等高线和响应面图Fig.4 Contours and response surface plots of the interaction between enzymatic temperature and enzymolysis time

图5 超声时间和酶解时间交互作用的等高线和响应面图Fig.5 Contours and response surface diagrams for the interaction of ultrasonic time and enzymolysis time

根据回归模型分析可知,超声波酶法提取桑葚籽黄酮的最佳工艺条件为复合酶添加量0.32 mg/mL、酶解温度55.98 ℃、酶解时间75.71 min、超声时间22.13 min。为了操作方便,修正最佳的提取条件为:复合酶添加量0.3 mg/mL、酶解温度为55 ℃、酶解时间为80 min、超声时间20 min,在此条件下,进行3次平行实验,所得桑葚籽黄酮得率平均值为5.32 mg/g,实测值与预测值5.36 mg/g相对误差仅为0.75%,因此证明实验模型合理,实验结果理想。

2.3 黄酮抗氧化活性

2.3.1 桑葚籽黄酮对DPPH自由基的清除作用 对桑葚籽黄酮清除DPPH自由基的能力进行研究,结果如图6A所示,当样品浓度在0.20～1.00 mg/mL范围内时,桑葚籽黄酮对DPPH自由基的清除能力远低于芦丁和维生素C;当浓度大于1.00 mg/mL时,其对DPPH自由基的清除能力与芦丁较接近;当维生素C浓度达到1.50 mg/mL时清除效果已达到94.7%,相同条件下,黄酮对DPPH自由基的清除率为89.58%。桑葚籽黄酮对DPPH自由基有显著的清除作用(p<0.05),而且其清除能力随着样品浓度的增加而增大,当浓度值达到一定值后趋于平缓。

图6 黄酮的体外抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of flavonoids in vitro

2.3.2 桑葚籽黄酮对羟自由基的抑制作用 如图6 B所示,当样品浓度低于0.6 mg/mL，芦丁对羟自由基的清除能力始终高于维生素C和黄酮；当浓度高于0.8 mg/mL时，维生素C的抑制作用增强，粗黄酮与芦丁的抑制作用接近；当样品浓度达1.20 mg/mL时,维生素C、芦丁和黄酮对羟自由基的抑制率分别为92.67%、90.05%和88.75%。随着样品浓度的增大,桑葚籽黄酮对羟自由基的抑制作用逐渐增强,且始终与芦丁和维生素C较接近。

2.3.3 对超氧阴离子自由基的清除作用 如图6C所示,三种溶液对超氧阴离子的清除效果区别明显,芦丁的清除作用最强,维生素C次之,粗黄酮最弱,但与维生素C较接近。当浓度为0.50 mg/mL时,芦丁的抗超氧阴离子活力单位已达到225 U/L,此时,粗黄酮的仅为76.02 U/L,随着浓度的增大,清除超氧阴离子的能力逐渐增强,最终达到258.88 U/L,所以,黄酮的抗氧化能力随着样品浓度的增大而增强。

2.4 黄酮的抑菌活性

2.4.1 不同浓度桑葚籽黄酮的抑菌效果 由表4可知,桑葚籽黄酮对4种菌株的生长均有一定程度的抑制作用,且抑制作用的大小与黄酮浓度呈明显的剂量关系[24],黄酮浓度越高,抑菌圈直径越大,且黄酮对沙门氏菌的抑制效果最为明显,抑菌能力强弱排序为:沙门氏菌>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>酵母菌。

表4 桑葚籽黄酮提取液的抑菌效果Table 4 Bacteriostasis effect of flavonoids extracted from mulberry seed

2.4.2 桑葚籽黄酮MIC的测定 观察8个不同浓度的桑葚籽黄酮溶液对4种试验菌株的最低抑菌浓度,结果如表5所示,其对沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌的MIC分别为0.75、1.50、1.00、2.00 mg/mL,从表5还可以看出:黄酮浓度越高,菌落生长越少。

表5 桑葚籽黄酮的最小抑制浓度(MIC)Table 5 Minimum inhibitory concentration(MIC)of flavonoids from mulberry seeds

3 结论

利用Box-Benhnken响应面分析法得到桑葚籽黄酮的最优提取条件为酶添加量0.3 mg/mL、酶解温度为55 ℃、酶解时间为80 min、超声时间20 min。在此条件下桑葚籽黄酮得率为5.32 mg/g,比酶法提取法提高19.7%。在一定程度上减少试剂用量,节约能耗,为桑葚籽黄酮提取开发利用方面提供理论依据。另外,所得的桑葚籽黄酮对DPPH自由基、羟自由基的清除作用随着其含量的增加而增强,且抗超氧阴离子自由基的活力也逐渐增强,表现出良好的抗氧化活性,可作为一种天然的抗氧化剂,为桑葚籽黄酮的综合开发利用提供理论依据。通过牛津杯法检测桑葚籽黄酮对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和酵母菌的抑菌能力大小为:沙门氏菌>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>酵母菌,MIC分别为沙门氏菌0.75 mg/mL、大肠杆菌1.50 mg/mL、金黄色葡萄球菌1.00 mg/mL、酵母菌2.00 mg/mL。