肉桂精油-玉米淀粉基抗菌膜的制备及其性能

肖力源，张淑瑶，周湘媛，周筱三，吴贺君，黎杉珊，申光辉，张志清

（四川农业大学食品学院，四川 雅安 625014）

针对合成包装材料生物降解性差、污染环境等问题，近年来研究人员对多糖类生物降解涂层或包装材料进行了广泛研究[1]。为防止食源性致病菌等造成食品腐败变质，人们向生物降解材料中添加天然抗菌剂制备活性包装，可以减少食品防腐剂的使用和延长食品保质期[2]。淀粉因其可生物降解、价格低廉和来源丰富已被用作生物降解塑料生产的原料。

植物精油来源天然、安全无毒，被美国食品药品监督管理局列为公认安全使用物，并被批准为食品添加剂[3]。研究发现植物精油可以抑制或延缓致病微生物的生长。李文茹等[4]研究肉桂、山苍子、丁香、香茅、迷迭香和大蒜6 种植物精油对黑曲霉、绳状青霉、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抗菌效果，发现肉桂精油的抗真菌和细菌活性最强，植物精油因化学成分不同抗真菌、细菌活性效果也会不同。另一方面，将植物精油添加在生物降解材料中其抗菌活性可在其中表达，但会影响聚合物的物理性能。Ghasemlou等[5]研究发现加入百里香和唇萼薄荷精油可改善玉米淀粉膜的断裂伸长率和水蒸气透过率，使膜颜色偏黄，2 种膜都显示出抗菌活性；Seydim等[6]将牛至、迷迭香和大蒜精油添加于乳清分离蛋白膜中，发现添加2%牛至精油和添加量大于3%的大蒜精油的膜有抑菌效果（P＜0.05），而添加迷迭香精油的膜没有显示任何抗菌活性。玉米淀粉基质膜是多糖生物降解材料中研究相对较多、也比较早的膜。但抗菌精油与玉米淀粉、壳聚糖和魔芋葡甘露聚糖等配合制备抗菌膜鲜见报道。

本研究选择牛至精油、百里香精油、迷迭香精油和肉桂精油，研究其对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性的大肠杆菌及沙门菌的抗菌活性，在以玉米淀粉、壳聚糖和魔芋葡甘露聚糖为成膜基材，甘油为增塑剂，吐温-80为表面活性剂的基础上，通过筛选添加最优抗菌性的植物精油，研究抗菌剂添加量对复合膜机械性能、阻水性、光学性能的影响，并通过抑菌圈法研究复合膜对3 种菌的抗菌效果，为开发应用新型抗菌降解包装技术提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米淀粉 重庆佳仙食品有限公司；壳聚糖（生物试剂，脱乙酰度90%） 上海源叶生物科技有限公司；魔芋葡甘露聚糖 成都光禾商贸有限公司；丙三醇、冰乙酸、吐温-80、氯化钠（均为分析纯），琼脂粉（生物试剂） 成都市科隆化学品有限公司；牛至精油、百里香精油、迷迭香精油、肉桂精油 吉安盛大香料油有限公司；牛肉膏、蛋白胨（均为生物试剂）北京奥博星生物技术有限责任公司；金黄色葡萄球菌（ATCC29213）、大肠杆菌（ATCC25922）、沙门菌（ATCC8389） 四川农业大学食品学院。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、琼脂20 g/L、蒸馏水1 000 mL。

1.2 仪器与设备

Sartorius CP225D型电子天平 德国赛多利斯公司；UV-3100紫外-可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司；PERME W3/031水蒸气透过率测试仪 济南兰光机电技术有限公司；TA.XT Plus质构仪 超技仪器有限公司；YXQ-LS-50S11立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司；SW-CJ-2FD洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；ZWY-211B恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司；SC-10便携式色差仪 苏州欣美和仪器有限公司；FJ200-SH数显恒速高速分散均质机 上海垒固仪器有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵 巩义市英峪华科仪器厂；HWS28电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；HD-E702-100型恒温恒湿箱 海达国际仪器有限公司；79-1磁力加热搅拌器 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；148-121型螺旋测微器 郑州中天实验仪器有限公司；数显游标卡尺（0～150 mm） 世达工具（上海）有限公司；玻璃成膜板（内腔23 cm×28 cm） 自制。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化与菌悬液制备

分别将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌斜面培养活化2 次，从活化2 次斜面培养基上取1 菌环量菌种接种到100 mL营养肉汤培养液，于37 ℃、200 次/min振荡培养24 h后，10 倍梯度稀释，取浓度106CFU/mL菌悬液备用[7]。

1.3.2 精油最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）的测定

将牛至精油、百里香精油、迷迭香精油和肉桂精油分别先用60%乙醇溶液定容至800 mg/mL，采用双倍稀释法[8]稍作修改。标号试管1～11，每管加入1 mL营养肉汤培养液，取1 mL精油加入第1管中，之后连续双倍稀释8 管，从第9管移除1 mL。每管接入1 mL实验菌悬液，涡旋混匀，最终各管含菌量为105～106CFU/mL，每种植物精油质量浓度最终分别为400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5 mg/mL。37 ℃培养24 h，从各管中取出培养液100 μL，涂布平板培养24 h后观察。若有菌落生长，记为阳性（+）；若无菌落生长，记为阴性（－）。无细菌生长的精油最低浓度即为MIC。以不添加乙醇和精油的10号试管为空白对照，以仅添加1 mL 60%乙醇溶液的11号试管为阴性对照，每种处理做3 个平行样。在测出MIC的基础上，从无菌生长的试管中取出100 μL培养液加入到10 mL营养肉汤中稀释混匀，37 ℃培养24 h，平板涂布观察有无细菌生长，无菌生长的最小浓度即为MBC。阴性和空白对照同MIC标号组，每种处理做3 个平行[9]。

1.3.3 抗菌膜的制备

称取10 g玉米淀粉于100 mL蒸馏水中，95 ℃恒温水浴糊化15 min，固定壳聚糖和魔芋葡甘露聚糖总质量1.6 g，称取壳聚糖与魔芋葡甘露聚糖质量比为1.0∶0.6，壳聚糖溶于100 mL 1%乙酸溶液，魔芋葡甘露聚糖溶于100 mL蒸馏水。将上述3 种溶液混合，依次加入7.5 mg/L丙三醇、2.5 mg/L吐温-80（以300 mL蒸馏水计），再将不同质量浓度0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L（以300 mL蒸馏水计）精油加入混合成膜液中，10 000 r/min均质4 min，真空脱气25 min。将排气泡后的成膜液120 g于预先清洗干净的玻璃板流延成膜，于40 ℃、24 h干燥箱烘干揭膜，置于相对湿度55%、25 ℃环境平衡48 h后测定性能。未添加吐温-80的薄膜制备步骤同上。

1.3.4 抗菌膜性能测定

1.3.4.1 膜厚度的测定

根据GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的测定 第3部分：薄塑和薄片的试验条件》的测试方法[10]，将膜裁成150 mm×15 mm薄条，用螺旋测微器测量复合膜对角线端及中央各随机一点厚度（每张膜随机选取5 个点）。

1.3.4.2 机械性能测定

在1.3.4.1节测定膜的基础上，在TA-XT2i物性测试仪上测定薄膜的抗拉强度（tensile strength，TS）和断裂伸长率（elongation at break，EAB），设置测速为50 mm/min，初始距离为100 mm。每个样品重复测量3 次取平均值[10]。

1.3.4.3 水蒸气透过系数（water vapour permeability，WVP）测定

依据GB 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法 杯式法》[11]，使用PERME W3/031水蒸气透过率测试仪测定复合膜的WVP，测试温度38 ℃，相对湿度90%，每个样品重复测量4 次，每组实验重复3 次。单位为10－12g/（cm·s·Pa）。

1.3.4.4 光学性能测定

将薄膜裁成12 mm×40 mm矩形，紧贴于比色皿一侧，在600 nm波长处测定其吸光度，按公式（1）计算不透明度，以空比色皿作为对照，测5 个平行样，单位为mm－1[12]。

式中：A600nm为样品膜在波长600 nm处的吸光度；x为样品膜厚度/mm。

使用便携式色差计依照CIE LAB模式表示抗菌膜颜色。用标准白板GSB A67002-86（L=96.69，a=－0.64，b=0.28）校正，将膜样品平放在白色校正板上，测定L、a、b和总色差ΔE值。颜色指数是L=0（黑色）到L=100（白色），－b（蓝色）到+b（黄色），－a（绿色）到+a（红色）。每个样品选择3 个点进行测量，取平均值，按公式（2）计算[5]：

式中：L*、a*和b*为玉米淀粉基膜样品的颜色指数；L、a和b为标准白板颜色参数。

1.3.4.5 抑菌性能测定

用打孔器将不同浓度抗菌薄膜裁剪成12 mm直径圆片，未添加精油薄膜为对照样片，紫外灭菌20 min。在牛肉膏蛋白胨培养基表面接种100 μL实验菌悬液（106CFU/mL），用无菌涂布棒均匀涂抹3 次。每个平板贴放1 片实验样片，置于37 ℃培养24 h后用测定抑菌圈直径（包含膜片直径），取平均值，每组实验重复4 次[13]。

1.4 数据统计与分析

使用SPSS 20.0、Origin 9.0软件进行数据处理，ANOVA法进行方差分析，Duncan多重比较法检验进行显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 4 种植物精油抗菌活性比较及最佳抑菌精油筛选

表1 4 种植物精油对实验菌的MIC和MBCTable1 MIC and MBC of four typical essential oils against bacteria

如表1所示，牛至精油和迷迭香精油对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌的抑制作用较强，对革兰氏阴性的大肠杆菌和沙门菌的抑制作用较弱。肉桂精油对3 种实验菌的MIC虽然在本实验设计梯度中相同，但对不同实验菌的真实抑菌浓度可能在3.125 mg/mL与更低梯度之间。在4 种精油中肉桂精油对3 种实验菌的MIC和MBC均最低。综上所诉，4 种精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌都具抑菌效果。抗菌活性从强到弱依次为：肉桂精油＞牛至精油＞百里香精油＞迷迭香精油。故选用肉桂精油作为玉米淀粉基膜的抑菌剂。

2.2 肉桂精油质量浓度对玉米淀粉基膜机械性能的影响

图1 肉桂精油质量浓度对玉米淀粉基膜TS（A）和EAB（B）的影响Fig.1 Effects of different concentrations of cinnamon essential oil on TS (A) and EAB (B) of corn starch-based fi lms

如图1所示，随着精油质量浓度的增加，薄膜的TS从对照组（20.40±0.64）MPa逐渐降低至（11.71±0.83）MPa，当精油质量浓度由0.0 g/L增加至10.0 g/L，TS显著降低（P＜0.05），10.0 g/L和15.0 g/L以及20.0 g/L和2 5.0 g/L两组精油对应的薄膜抗T S无明显差异（P＞0.05）。而EAB呈先增加后降低的趋势，精油质量浓度为20.0 g/L时达到最大值（36.47±0.53）%。精油对薄膜机械性能的影响取决于精油种类、增塑剂和表面活性剂的使用等[14]。表面活性剂吐温-80与肉桂精油在成膜液中可形成胶束，吐温-80分别与肉桂精油和淀粉相互作用，因此淀粉链间的氢键/相互作用可以被淀粉和吐温-肉桂精油胶束间的氢键/相互作用代替，这改变了聚合物基质的完整性并降低了复合膜的TS[15-16]。而这种代替也造成淀粉链分子流动性增加[17]，导致复合膜柔韧性提高EAB增加。

2.3 肉桂精油质量浓度对玉米淀粉基膜WVP的影响

表2 肉桂精油质量浓度对玉米淀粉基膜WVP的影响Table2 Effect of different concentrations of cinnamon essential oil on WVP of corn starch-based fi lms

如表2所示，将肉桂精油加入玉米淀粉基膜中导致WVP从（1.94±0.02）×10－12g/（cm·s·Pa）降低至（1.60±0.03）×10－12g/（cm·s·Pa）。但质量浓度为5.0 g/L时薄膜WVP无显著差异（P＞0.05），这可能由于精油和玉米淀粉基膜内部交联过程产生的微孔结构所致[18]。水蒸气的转移一般发生在薄膜亲水区，取决于膜组分的亲水-疏水比形成的曲折路径，因此通常认为向亲水性聚合物膜中添加疏水性脂质可以改善阻水性能[19]。前人关于添加百里香、丁香和肉桂精油的壳聚糖膜、添加牛至精油的海藻酸钠膜、添加百里香精油的玉米淀粉膜等WVP研究已显示出类似的趋势[5,18,20]。但也有其他关于添加精油制膜相反的研究结果，Hosseini等[21]在鱼明胶-壳聚糖膜中添加牛至精油发现WVP从0.41 g·mm/（h·m2·kPa）增加至0.76 g·mm/（h·m2·kPa），由于脂滴引起聚合物网络不连续，造成膜内聚力降低从而增加水蒸气透过[22]。另有研究表明，尽管脂质对薄膜微观结构的改变是影响阻水性能好坏的决定因素，但是不能由向成膜体系中添加疏水性成分的方式就简单得出薄膜WVP降低的结论[18,23]。而本研究结果显示当肉桂精油质量浓度为10.0～25.0 g/L时，与对照组相比玉米淀粉基膜的WVP显著降低（P＜0.05）。

2.4 肉桂精油质量浓度对玉米淀粉基膜光学性能的影响

表3 肉桂精油质量浓度对玉米淀粉基膜光学性能的影响Table3 Effect of different concentrations of cinnamon essential oil on optical properties of corn starch-based fi lms

如表3所示，当肉桂精油质量浓度从5.0 g/L增加到15.0 g/L时，L*值没有明显差异（P＜0.05），而a*、b*和ΔE值在相同质量浓度范围内显著变化（P＜0.05）。当肉桂精油质量浓度从15.0 g/L增加至25.0 g/L时，a*值没有显著差异（P＞0.05），而ΔE值与b*值呈增加的趋势，说明肉桂精油-玉米淀粉基膜颜色向黄色变化，这一变化是由精油本身色素导致。随着肉桂精油质量浓度增加玉米淀粉基膜不透明度与对照组相比显著增加（P＜0.05），当质量浓度为25.0 g/L时肉桂精油-玉米淀粉基膜不透明度为7.29 mm－1，是对照组的1.6 倍。Ghasemlou等[5]将百里香和唇萼薄荷精油添加至玉米淀粉基膜中同样发现随着精油的加入使薄膜不透明度增加。这可能是由于光线在通过脂滴时发生散射导致漫反射增加[1]，降低了薄膜的透明度。在这种情况下，玉米淀粉基膜外观呈现黄色，但仍保持透明，如图2所示，说明其在添加后能很好保持膜的色泽特性。

图2 含不同质量浓度肉桂精油的玉米淀粉基膜照片Fig.2 Photographs of corn starch-based fi lms with different concentrations of cinnamon essential oil

2.5 肉桂精油质量浓度对玉米淀粉基膜抑菌性能的影响

表4 不同肉桂精油质量浓度的玉米淀粉基膜抑菌圈直径Table4 Inhibition zone diameters of corn starch-based fi lms with different concentrations of cinnamon essential oil

如表4所示，添加表面活性剂吐温-80中，未添加精油的对照组对3 种实验菌均未表现出抑菌性能，而随着精油质量浓度从5.0 g/L增加到25.0 g/L，膜对3 种实验菌的抑菌性能显著增强（P＜0.05），均具良好抗菌作用。通常认为精油及其疏水性组分能直接作用于细胞膜，抑制酶与蛋白结合，增加细胞膜磷脂双分子层渗透性，导致膜破坏[24]，一般对革兰氏阳性菌的抑菌作用要强于革兰氏阴性菌。但在本研究中发现添加肉桂精油的复合膜对属于革兰氏阴性的大肠杆菌和沙门菌的抑菌圈直径比对属于革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大，特别当肉桂精油质量浓度为20.0 g/L和25.0 g/L时，大肠杆菌的抑菌圈直径是金黄色葡萄球菌对应抑菌圈直径的2 倍以上。这可能归因于精油和表面活性剂吐温-80相互作用，高速均质后乳化分子粒径减小、亲水基团暴露，通过外膜转运蛋白将精油有效递送至革兰氏阴性菌的细胞膜内[25-26]。另一方面，表面活性剂的种类也会影响抑菌效果。Li Wei等[27]研究阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠和非离子型表面活性剂吐温-80对丁香酚乳液抑菌能力影响，发现离子型表面活性剂乳剂对金黄色葡萄球菌更敏感，而非离子表面活性剂乳剂对大肠杆菌更敏感。

未加吐温-80的复合膜抑菌结果证实了以上结论。随着精油质量浓度从10.0 g/L增加至25.0 g/L，膜对3 种实验菌的抑菌性能仍显著增强（P＜0.05）。但失去表面活性剂作用后，膜对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌的抑菌作用变得强于革兰氏阴性的大肠杆菌，这与一般研究精油的抑菌结果一致[4]。在同等精油质量浓度条件下，未添加吐温-80的复合膜对沙门菌的抑菌效果有所减弱，可能是因为成膜液中缺少乳化效果导致烘干过程中精油在薄膜的截留量降低，这也解释了当添加质量浓度为5.0 g/L时复合膜未表现出抑菌性能。在2.1节中，肉桂精油对3 种实验菌的MIC相同均为3.125 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MBC低于大肠杆菌。而肉桂精油经过与非离子型表面活性剂吐温-80作用，对金黄色葡萄球菌显示出比未乳化前更低的抑菌活性，对大肠杆菌却增强抑菌活性。在前人研究中同样得到此结果，如在改性淀粉中添加薄荷精油[28]、乳清蛋白-麦芽糖糊精添加丁香酚[29]显示出更低的抑菌活性，而在酪蛋白酸钠中添加百里香精油[30]、海藻酸钠-吐温-80添加柠檬精油[31]却增强抑菌活性。

3 结 论

根据植物精油抗菌活性实验的结果，肉桂精油对大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为3.125 mg/mL，对沙门菌和金黄葡萄球菌的MBC均为12.5 mg/mL，对大肠杆菌的MBC为25 mg/mL。4 种植物精油的抗菌活性由强到弱依次为：肉桂精油＞牛至精油＞百里香精油＞迷迭香精油，因此选取肉桂精油作为复合膜的抑菌剂。添加肉桂精油降低了玉米淀粉基膜的TS和WVP，提高了膜的EAB和不透明度。当精油质量浓度为20.0 g/L时，膜的TS和EAB影响显著（P＜0.05），此时EAB最大，分别为（12.76±0.84）MPa和（36.47±0.53）%。与对照相比，肉桂精油的加入显著增加了膜的不透明度（P＜0.05），当精油质量浓度大于10 g/L时，膜的WVP显著降低（P＜0.05）。加入肉桂精油改变了膜的颜色，其b*值和ΔE值显著增加（P＜0.05），L*和a*值降低，膜呈现黄色。添加肉桂精油显著增强膜对3 种实验菌的抗菌能力（P＜0.05），发现精油与吐温-80相互作用对革兰氏阴性的大肠杆菌具有协同作用，当质量浓度大于20 g/L，抑菌圈直径超过30 mm最大达到（47.71±2.42）mm；而对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌具有拮抗作用，当质量浓度为25.0 g/L时抑菌圈直径为（19.86±0.20）mm；对沙门菌无明显增强或减弱效果，当质量浓度为25.0 g/L时抑菌圈直径为（23.19±1.98）mm。建议20.0 g/L肉桂精油为最佳质量浓度，此时玉米淀粉基膜具有较好的物理性能和抗菌效果。