丝氨酸蛋白酶抑制剂B1在肝肺综合征大鼠肺组织中的表达变化

艾祥发 王海英

遵义医学院第一附属医院（贵州遵义563000）

肝肺综合征（HPS）是源于肝源性疾病晚期引起的以动脉氧合不足引起缺氧为特征的肺内出现的并发症［1］。病理的血管新生可以导致肺内通气/血流比值失衡和异常分流，从而加重肺部气体交换异常导致低氧血症，这是HPS的重要发生机制。本课题组前期研究已证实促血管生成因子参与病理性血管新生在HPS发生机制中发挥重要作用［2］。已有研究认为异常的血管新生是由于内皮细胞间连接松动，内皮细胞再次增殖和迁移所导致［3］。

丝氨酸蛋白酶抑制剂B1（SerpinB1）是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员，主要作用是保护组织细胞不受应激期间细胞质中的蛋白酶的损伤［4］。已有研究报道该蛋白在炎症中发挥作用，大量表达于炎症细胞，参与了肺部炎症的发生机制［5］。对溃疡性结肠炎患者的研究显示SerpinB1的表达不仅定位于炎症浸润细胞，而且也在结肠上皮细胞有表达［6］。另有研究报道SerpinB1在侵袭性口腔鳞状细胞癌中过表达并可促进口腔癌细胞迁移［7］。但SerpinB1在肺微血管内皮细胞是否表达及其变化以及与血管新生的关系仍未见报道。MAPK通路参与多种细胞增殖、分化的调控，最新研究发现SerpinB1通过激活ERK1/2及相关通路减轻自体肝移植后肺部炎症及氧化应激，减轻肺组织细胞凋亡［8］。本研究旨在探究SerpinB1参与调节肝肺综合征血管新生及其机制，为探讨通过抑制血管的生成来改善HPS的方法提供科研基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与器材小鼠抗GAPDH单克隆IgG、TRNzol总RNA提取试剂、苏木精、SDS⁃PAGE配胶试剂以购买于康为世纪公司（中国），蛋白酶抑制剂Cocktail购买于罗氏生物公司（美国），ECL发光液购买于重庆葆光生物有限公司，兔抗Erk1/2抗体、兔抗p⁃Erk1/2抗体购买于美国R&D公司，山羊抗SerpinB1抗体和小鼠抗CD34抗体购买于Peprotech（美国）公司，山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、驴抗山羊IgG购买自碧云天（中国）公司，逆转录试剂盒及荧光定量PCR盒从日本TaKaRa公司购买，PCR引物购买自赛默飞世尔科技（美国）公司。台式高速离心机购买自ThermoFisher公司，电泳仪购买自Bio⁃Rad公司。

1.2 实验动物及动物模型建立健康的SD大鼠40只，3～5月龄，雄性，重量为0.24～0.27 kg，使用抽签法将这些实验鼠分类为四组（n=10）：即假手术组（sham），胆总管结扎后1周组（1 W），胆总管结扎后3周组（3 W），胆总管结扎后5周组（5 W）。胆总管结扎组大鼠（CBDL组）用丝线分别结扎胆总管的近十二指肠端和近肝门端，并将游离胆总管剪断。Sham组即仅打开腹腔并暴露后缝合，不予结扎胆管；胆总管结扎后1周组、3周组、5周组分别于胆总管结扎后1、3、5周通过腹主动脉采血后取肺组织。血气指标PaO2＜85 mmHg且A⁃aDO2＞18 mmHg为HPS动物实验模型制作良好的指标。

1.3 实验方法

1.3.1 HE染色观察肺组织形态学改变肺组织用4%多聚甲醛固定12 h后进行石蜡包埋，切片厚约5 mm，行HE染色后在光镜下（200×）随机选十个视区观测肺组织及微血管病变。

1.3.2 免疫组化观察目的蛋白表达分布石蜡切片放置于60℃烤箱烘烤2 h后，将片子放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中1 h除石蜡、然后在浓度梯度酒精中脱水10 min/次；滴加 3%的 H2O2封片 40 min，高压锅抗原修复5 min后冷却至室温。山羊血清封片1 h，去掉血清滴加一抗（一抗稀释比例分别为SerpinB1 1∶200，Erk 1∶300，p⁃Erk 1∶300，CD34 1∶300），并放置于湿盒中4℃过夜后用PBS洗涤2～3次；滴加二抗工作液放在37℃温箱中1 h，PBS缓冲液进行充分洗涤；滴加DAB显色液于显微镜下观察着色后充分冲洗；苏木精染色10 s后冲洗；按照75%乙醇→二甲苯I的顺序脱水并封片，最后对制作好的切片进行观察和拍照。从每个组化切片挑选至少五个视野，并通过Image Proplus和累积光密度值（IOD）指标对表达量进行量化。

1.3.3 微血管密度（MVD）的评估选择抗CD34的一抗并使用免疫组化的方法标记各组肺组织CD34阳性细胞，在高倍镜（200×）下观察计数，并将CD34阳性细胞数所占比作为微血管密度。每个肺组织切片至少选取5个视野，并用NIS⁃Elements AR软件计数CD34阳性细胞，统计CD34阳性细胞的比例，算出微血管密度。

1.3.4 qRT⁃PCR实验按TRNzol RNA试剂说明书操作步骤获取肺组织中总的RNA；用分光光度计检测提取RNA的浓度，按相关说明使用TaKaRa反转录试剂盒和T100反转录仪器将RNA反转录为cDNA，按说明书操作用特异引物将cDNA片段扩增，荧光定量PCR系统检测目的基因的Ct值，以内参选取GAPDH，并算出相对表达量。

1.3.5 Western blot实验将肺组织用研钵磨碎后，滴加约800 μL的RIPA裂解液及Cocktail蛋白酶抑制剂（100×）提取组织蛋白，用BCA法检测样品蛋白浓度。制备10%SDS聚丙烯胺凝胶，每孔上样量为60 μg，70 V/90 V电泳结束后转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，分别加入一抗于湿盒中4℃冰箱进行孵育（SerpinB1 1∶800，GAPDH 1∶2 000）过夜，然后用TBST对膜进行清洗；二抗（1∶3 000）室温孵育100 min，TBST清洗膜8 min×4次，滴加ECL发光试剂进行显影，各组实验重复3次。结果用Image Lab软件进行灰度值测量，用目的蛋白灰度值除以GAPDH灰度值得到相对值用于统计。

1.4 统计学方法本实验选择SPSS 19.0，计量数据资料以均数±标准差展示，多个组之间相比选用单个因素方差分析，两个组之间对比均数使用t检验，组间相关性分析用相关系数r分析比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CBDL大鼠肺组织大体观察及血气分析结果肺组织大体可见sham组大鼠肺色泽红润，无出血点，无组织病变和坏死（图1A）；CBDL 1周组大鼠可见少量点状病变（图1B）；CBDL 3W组大鼠肺组织色泽暗淡，出现较多点状病变和部分融合病变（图1C）；CBDL 5周组大鼠肺组织色泽暗淡，可见大量点状病变和较多融合病灶，伴有肺组织坏死（图1D）。

血气分析结果表明与Sham组大鼠比较，CBDL组大鼠氧分压降低而肺泡-动脉血氧分压差升高，在CBDL 3周及CBDL 5周时以上变化有统计学差异（P＜ 0.05）其中 CBDL 5WA⁃aDO2增大最明显（P＜0.01）见表2。

图1 各组大鼠肺组织大体外观Fig.1 Appearance of lung tissue in each group

表2 各个组大鼠之间血气数值比较（n=10）Tab.2 Comparison of blood gas value among rats in each group（n=10） ±s，mmHg

表2 各个组大鼠之间血气数值比较（n=10）Tab.2 Comparison of blood gas value among rats in each group（n=10） ±s，mmHg

注：与Sham组比较，*P＜0.05

指标PaO2 A⁃aDO2 Sham组96.2±2.4 8.0±1.5 1周组89.7±3.0 13.2±1.4 3周组80.0±1.7*20.1±0.9*5周组75.6±1.2*22.7±0.7*

2.2 CBDL大鼠肺组织HE染色及形态观察HE染色可观察到，Sham组大鼠肺组织结构相对完整，细胞胞质丰富，胞核染色均匀（图2A）。与Sham相比，CBDL 1周组大鼠肺部有较多炎症细胞浸润，肺泡结构出现紊乱（图2B）；CBDL 3周组大鼠肺泡结构严重紊乱被破坏，血管腔扩大明显且管腔内炎性细胞增多（图2C）；CBDL 5周组肺组织炎症细胞浸润明显，血管官腔直径增宽，组织结构被破坏且肺泡间隔明显增厚（图2D）。通过对多个切片样本进行观察后发现肺泡微血管直径在CBDL大鼠模型中有所扩张（图2E）。

2.3 SerpinB1、Erk1/2以及CD34在各组大鼠肺组织中mRNA水平的表达通过qRT⁃PCR定量结果发现，与Sham组比较SerpinB1、Erk1/2、CD34在CBDL组均表达上调（P＜0.01）；其中在1W肺组织mRNA水平表达量高于Sham组（P＜0.01），在3W肺组织mRNA水平表达量高于1周组（P＜0.01），在5周肺组织mRNA水平表达量高于3周组（P＜0.01，图3）。

2.4 SerpinB1及Erk1/2在各组大鼠肺组织中蛋白水平的表达Western blot实验证实SerpinB1在CBDL组相比Sham组均有表达上调（P＜0.01，图4），表明CBDL大鼠模型中SerpinB1可能参与了HPS疾病进展。同时免疫印迹法检测到Erk1/2及p⁃Erk1/2的表达上调（P＜ 0.01，图4），并且Erk1/2表达升高（P＜0.01）与SerpinB1的变化具有相关性（r=0.884，P＜0.05）。表明SerpinB1可能通过调控Erk1/2参与到肝肺综合征的发病机制中。

图2 大鼠肺组织HE切片观察（HE 200×）Fig.2 HE sections of rat lung tissue（HE 200 ×）

图3 SerpinB1、Erk1/2以及CD34在大鼠肺组织中mRNA表达Fig.3 mRNA expression of SerpinB1,Erk1/2 and CD34 in rat lung tissue

图4 免疫印迹法检测SerpinB1及Erk1/2在肺中的表达情况及统计Fig.4 Immunoblotting assay for the expression of SerpinB1 and Erk1/2 in the lung tissue and statistics

2.5 SerpinB1在CBDL大鼠肺中的分布及表达情况进一步通过肺组织切片免疫组化染色结果可见，SerpinB1主要表达于微血管内皮细胞、炎症细胞以及部分肺泡上皮细胞，SerpinB1在CBDL组表达相对于Sham组明显增加（P＜0.01），并且表达量随着CBDL建模周数的增加逐渐递增。表现为SerpinB1在CBDL 3周组表达量高于CBDL 1周（P＜0.01），CBDL 5周组表达量高于CBDL 3周组（P＜ 0.01，图5A⁃E）。

2.6 Erk1/2及CD34在CBDL大鼠肺组织中的表达分布染色结果表明Erk1/2，p⁃Erk1/2以及CD34主要表达于微血管内皮细胞，并且在CBDL 3W组的表达高于Sham组（P＜0.01）。与Sham组相比较，CBDL 3周组大鼠肺组织中p⁃Erk/Erk的表达量有所上调（P＜0.01），CBDL 3周组CD34的表达也显著升高。用CD34阳性细胞百分比作为肺组织微血管密度（MVD）的指标，评估发现CBDL 3周组大鼠肺组织微血管密度显著增加，并且与SerpinB1上调呈正相关（r=0.795，P＜ 0.05）（图6A，B）。

3 讨论

严重的慢性肝病的发生主要由肝细胞功能衰竭和门脉高压作用引起，其中约有15%～30%发生与原发肺部病变无关的肺部并发症，即HPS；HPS的存在损害患者的生活质量并增加了患者的病死率，需要肝移植治疗才可逆转［9-10］。现有研究认为HPS患者发生难以纠正的低氧血症的发生机制主要包括：肺泡通气-血流灌注失调、肺泡内气体弥散障碍以及动静脉分流［11］；这些病理改变主要与肝功能受损引起肺部微血管异常扩张［12］，肠道细菌的异常转移［13］，肺内单核-巨噬细胞活化并释放炎症因子［14］，以及血管新生增强也是实验性HPS发生的重要因素［15］。

图5 免疫组化法检测大鼠肺组织中SerpinB1表达情况（200 ×）Fig.5 Detection of SerpinB1 expression in rat lung tissue by immunohistochemistry（200 ×）

SerpinB1属于丝氨酸蛋白酶抑制剂这一家族中的成员，Serpin家族参与多种生化反应，包括调节凝血（血栓形成和溶栓），神经营养因子，激素转运，补体和炎症，激素转运，血管生成和血压等［16］。已有报道 PAI⁃1（SerppinE1）［17］、Maspin（SerpinB5）［18］、SerpinB3及SerpinB13等均与血管新生有关系，其中Maspin（SerpinB5）在肿瘤中的效应表现为抗肿瘤血管新生、抑制迁移和浸润，其与整合素β1的活化密切相关［18］。以往的研究发现SerpinB1在急性肺损伤中通过激活Erk1/2通路改善急性氧化应激和减轻内皮细胞凋亡从而起到保护作用［8］，这表明SerpinB1在内皮细胞的增殖过程中扮演关键角色。本研究结果发现HPS组大鼠血气分析结果PaO2降低且A⁃aDO2升高（表2），HE染色结果表明HPS大鼠肺组织结构被破坏及肺间隔增厚（图2），进一步研究发现SerpinB1的mRNA水平及蛋白表达水平均上调（图3、图4），通过免疫组化发现主要分布于微血管内皮细胞和炎症细胞（图5），提示SerpinB1在HPS的发生机制中可起到重要作用。

图6 Erk1/2及CD34在CBDL大鼠肺组织中的表达分布Fig.6 Distribution and expression of Erk1/2 and CD34 in lung tissue of CBDL rats

内皮细胞生长和增殖对于血管生成是关键的［19］，实验组前期研究已证实Erk1/2在实验性HPS中对血管新生的重要性［20］。本研究通过免疫印迹实验检测到HPS组大鼠Erk1/2蛋白水平的上调并且与SerpinB1的表达具有相关性（r=0.884，P＜0.05）。CD34是微血管内皮细胞重要的标志物，CD34阳性比例可表示血管新增数量，本实验证实CD34阳性细胞数在HPS大鼠中的表达较Sham组明显增高并且并且与SerpinB1上调呈正相关（r=0.795，P＜0.05），这表明SerpinB1可能参与到内皮细胞增殖及血管新生的调控，并且可能与激活Erk1/2，促进Erk1/2磷酸化有密切关系。

综上所诉，通过调控SerpinB1的表达水平来从而抑制内皮细胞的增殖，可以有效抑制HPS患者肺血管新生，从而改善肺内分流和缺氧状态。本实验将SerpinB1及Erk1/2与肺血管新生联系在一起进行研究，提出一种可能存在的调控途径，为肝肺综合征的治疗提供新靶点。但本研究仅局限于CBDL模型体内研究SerpinB1的表达变化及其与Erk1/2的关系，尚未进行干扰SerpinB1表达后的观察，尚未在内皮细胞水平进一步证实。下一步深入研究需要在细胞水平进行干扰后并观察其对内皮细胞增值迁移能力的影响。