呼吸病学、结核病学

结核分枝杆菌耐药相关基因扩增多重PCR体系的建立与评估

李自慧，潘丽萍，孙琦，等

摘要：目的：耐药结核病的流行严重威胁全球结核病的控制。了解细菌耐药情况有助于临床医生为患者及时选择有效的抗结核药物，但基于细菌培养技术的传统表型药物敏感性试验（简称“药敏试验”）需要2～3 个月才能得到结果。已有的研究证实基因突变是导致结核分枝杆菌耐药的重要原因，然而目前的耐药基因突变检测方法在敏感度和检测的耐药种类方面仍无法满足临床需求。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是耐药基因突变分子检测的基础。本研究针对目前已发现的多个结核分枝杆菌耐药基因，建立多重PCR 扩增体系，评估该体系以不同来源结核分枝杆菌DNA 样本为模板同时扩增多个耐药基因的成功率。方法：结核分枝杆菌临床分离菌株首先用溶菌酶（5 mg/mL）37℃过夜消化、蛋白酶K（1 mg/mL）及10%十二烷基硫酸钠37℃孵育1 h，然后按照DNA 小量提取试剂盒（51304，Qiagen公司）说明书提取菌株DNA。菌阳肺结核患者的痰液首先采用N-乙酰-L-半胱氨酸氢氧化钠液化、与玻璃珠混合后室温剧烈涡旋，进行热灭活后离心收集上清，再用常规乙醇沉淀法提取痰菌DNA。参照目前已发现的结核分枝杆菌耐药基因及相关文献，设计合成引物，优化建立多重PCR 体系以扩增所有目的基因，并将扩增片段测序比对证实。最后分别以结核分枝杆菌临床分离株DNA样本和菌阳肺结核患者痰菌DNA 样本为模板扩增，扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳，计算该多重PCR 体系同时扩增耐药基因片段的成功率。结果：本研究针对临床常用的8 种抗结核药物（利福平、异烟肼、乙胺丁醇、氟喹诺酮、链霉素、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素），选取结核分枝杆菌rpoB、katG、inhA、embB、gyrA、rpsL、rrs、eis 这8 个较确切的耐药基因，分别设计合成引物，最终利用2 个多重PCR 体系成功扩增了8 个DNA 片段。这些片段经测序比对证实均为目的基因片段。优化后的扩增条件为：95℃ 10 min，（95℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 40 s）×30 个循环，72℃ 5 min。这些片段包含常见的耐药基因突变位点，其中rpoB（1123～1531）、katG（438～1072）、gyrA（-29～394）、embB（852～1962）、rpsL（12 位点后区域）、rrs（1158 位点后区域）、inhA 和eis 覆盖启动子基因突变位点区域。以琼脂糖凝胶电泳结果同时显示8 个耐药基因片段为成功标准，该多重PCR体系扩增结核分枝杆菌临床分离株DNA 模板的成功率为100.0%（47/47），扩增菌阳肺结核患者痰菌DNA 模板的成功率为76.2%（16/21）。结论：本研究建立了利用2 个多重PCR 高效扩增8 个结核分枝杆菌耐药相关基因的体系，该体系扩增的基因片段包含了目前已发现的主要耐药基因突变位点。本研究结果为进一步应用测序、芯片杂交等技术确定突变形式奠定了基础，对未来研发结核病耐药分子诊断产品、快速预测患者耐药类型、正确选择抗结核药物和控制耐药结核病疫情具有重要意义。

来源出版物：中国防痨杂志, 2017, 39(8): 793-798

入选年份：2017

北京地区成人社区获得性肺炎患者中肺炎支原体耐药情况的多中心调查

尹玉东，曹彬，王辉，等

摘要：目的：了解北京地区成人社区获得性肺炎（CAP）患者中肺炎支原体对大环内酯等常用抗生素的耐药情况。方法：收集2010年9月至2012年6月北京地区解放军总医院、北京大学人民医院、北京朝阳医院3 家医院就诊的CAP 患者。选择符合2006年中华医学会呼吸病学分会制定的CAP 诊断和治疗指南中规定的诊断标准；年龄≥18 岁的患者。排除标准：（1）具有免疫抑制性疾病患者（包括接受实体器官、骨髓或干细胞移植者）；（2）接受化疗的癌症患者或长期（＞30 d）接受大剂量皮质激素治疗者；（3）先天性或获得性免疫功能缺陷者；（4）合并严重肝肾功能不全者：丙氨酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶≥正常值3 倍；血肌酐清除率＜ 25 mL/min。采集咽拭子标本进行肺炎支原体培养。对分离到的肺炎支原体菌株进行体外药敏试验及对大环内酯类耐药相关基因突变位点检测。结果：321 例CAP患者入选，其中男159 例，女162 例。年龄18～108岁，平均（44±21）岁，共分离出肺炎支原体53 株，其中红霉素耐药38 株（71.7%）；阿奇霉素耐药32 株（60.4%）；未发现对喹诺酮及四环素类药物耐药的菌株。与非支原体肺炎患者比较，支原体肺炎患者平均年龄显著低于非支原体感染患者（P＜0.001），支原体肺炎患者血白细胞计数显著低于非支原体感染患者（P＜0.001）。临床症状等其他方面两组患者无显著差异。肺炎支原体敏感株与耐药株感染的两组患者在年龄、性别、入组前应用抗生素治疗史等方面均无明显差异。耐药株感染患者虽在入组后72 h 内退热比例及72 h 后更换抗生素比例略高于敏感株感染患者，但差异无统计学意义。A2063G 点突变是导致对大环内酯类抗生素耐药的主要点突变。结论：北京地区成人CAP 肺炎支原体对大环内酯类抗生素耐药率高，未发现喹诺酮及四环素类耐药菌株。

来源出版物：中华结核和呼吸杂志, 2013, 36(12): 954- 958

入选年份：2017

不同病因儿童慢性咳嗽气道高反应的特征

于兴梅，朱海艳，郝创利，等

摘要：目的：研究不同病因儿童慢性咳嗽的气道高反应性（AHR）特征。方法：纳入2012年4月至2013年12月于苏州大学附属儿童医院呼吸科就诊并明确为单病因的慢性咳嗽患儿，纳入标准：（1）慢性咳嗽时间＞4 周，以咳嗽为主要症状或唯一症状；（2）X 线胸片检查无明显病变；（3）近2 周未服用糖皮质激素、抗组胺药、支气管舒张剂等对检查造成影响的药物；（4）能够完成相关检查，配合治疗随访，病因诊断明确；（5）既往无合并其他系统严重疾病影响本研究正常进行者。采用支气管激发试验测得FEV1 下降20%时组织胺累计剂量（PD20），依据PD20 将AHR 严重程度分为重度、中度、轻度、极轻度4 级，同时测定诱导痰嗜酸粒细胞（EOS）计数和呼出气一氧化氮（FeNO）浓度，按儿童慢性咳嗽指南推荐方案进行治疗，4 周后随访，复查上述指标。结果：共纳入患儿66 例，其中咳嗽变异性哮喘（CVA）17 例，上气道咳嗽综合征（UACS）37 例，感染后咳嗽（PIC）12 例。CVA、UACS 及PIC 组AHR阳性初诊例数分别为17、13 和9 例，4 周复诊时分别为17、5 和2 例。AHR 严重程度分级，初诊时CVA、UACS和PIC 组中～重度分别为5、0 和0 例，轻度～极轻度分别为12、13 和9 例，阴性分别为0、24 和3 例；4 周后复诊CVA、UACS 和PIC 组中～重度度分别为1、0和0 例，轻度～极轻度分别为16、5 和2 例，阴性分别为0、32 和10 例。CVA 组PD20 值为（0.47±0.28）mg，低于UACS 组和PIC 组[分别为（1.80±0.64）和（1.20±0.80） mg]，差异均有统计学意义（P<0.01）。CVA组的诱导痰EOS 比例均>3%，UACS 和PIC 组均＜3%。FeNO 与痰EOS 比例呈正相关（r＝0.687，P＝0.000）。结论：不同病因儿童慢性咳嗽气道高反应的严重程度和持续时间不同，气道激发试验结合诱导痰对慢性咳嗽病因诊断有重要价值。

来源出版物：中华结核和呼吸杂志, 2015, 38(1): 55-58

入选年份：2017

2010年与2000年中国城市儿童支气管哮喘 患病率比较

沙莉，邵明军，刘传合，等

摘要：目的：调查中国城市0～14 岁儿童2010年与2000年10年间支气管哮喘（哮喘）的患病情况并进行对比。方法：选取2000年、2010年均参与了全国0～14 岁城市儿童哮喘患病率调查的城市，要求两次调查均为中心城区，调查样本量符合要求。两次调查均采用多阶段分层随机整群抽样方法，使用统一问卷筛查可疑儿童哮喘患者。筛查阳性儿童由临床医生通过现场问诊、体检及查阅既往病历记录和辅助检查结果，明确哮喘诊断。数据使用Epi-Info 软件进行双录入，用SPSS 19.0 软件进行统计分析。结果：全国共有33 个城市入选本次研究，2000年、2010年33 个城市儿童哮喘的现患率分别为1.59%（5317/334985）和2.11%（7382/350347），呈显著上升趋势。两次调查患病率最高的城市分别为合 肥（分别为3.91%和4.60%）和上海（分别为3.34%和5.28%），最低的城市为西宁（分别为0.12%和0.93%）和拉萨（分别为0.52%和0.26%）。大多数城市患病率呈不同程度升高，其中以温州、上海和西宁上升最为明显。两次调查男孩患病率显著高于女孩，分别为1.67∶1.00 和1.58∶1.00。两次调查中患病率最高的年龄段均为学龄前期（3～6 岁）。两次调查结果显示，学龄儿童哮喘6 岁前发病分别为84.32%（2538/3010）和78.55%（2917/3714），婴幼儿期发病患儿比例分别为54.92%（1653/3010）和43.30%（1608/3714）。结论：2010年我国城市儿童的哮喘患病率明显高于2000年，2010年14岁以下儿童的患病率较10年前上升32.70%；大多数城市哮喘患病率较前升高，患病率较高者集中在省会和东部沿海城市；学龄前期是儿童哮喘患病率最高的年龄段，与10年前比较，目前哮喘发病年龄后移，学龄前和学龄期发病有所上升。

来源出版物：中华结核和呼吸杂志, 2015, 38(9): 664-668

入选年份：2017

非显性因素所致慢性阻塞性肺疾病急性加重合并肺栓塞的临床特征与相关因素分析

王同生，毛毅敏，孙瑜霞，等

摘要：目的：探讨非显性因素所致 COPD 急性加重（AECOPD）发生肺栓塞的临床特征，并研究非显性因素所致AECOPD 合并肺栓塞的相关因素。方法：连续纳入因非显性因素所致AECOPD 患者208 例，年龄50～82 岁，平均（62±12）岁。入院24 h 内进行CT 肺动脉造影及双下肢静脉彩超检查，根据造影结果分为合并肺栓组69 例和无肺栓塞组139 例。均检测动脉血气分析、D-二聚体和内皮素-1。正态分布的计量资料采用t 检验，非正态分布资料采用Mann-Whitney u 检验，计数资料构成比的比较采用χ2检验，采用logistic 回归方程进行危险因素分析。结果：非显性因素所致AECOPD 患者合并肺栓塞者占33%（69/208）；合并肺栓塞组和无肺栓塞组卧床≥7 d 者分别占21.7%（15/208）和13.7%（19/ 208），双下肢不等粗≥1 cm 者分别占34.8%（24/208）和15.1%（21/208），深静脉血栓形成者分别占37.7%（26/208）和12.2%（17/208），晕厥者分别占11.6%（8/208）和0.06%（9/208），心电图表现为SⅠQⅢTⅢ综合征者分别占11.6%（8/208）和0.04%（5/208），PaCO2下降≥ 5 mm Hg（1 mm Hg＝0.133 kPa）者分别占27.5%（19/208）和9.3%（13/208），差异均有统计学意义（χ2值为4.32～6.79，P＜0.05）。合并肺栓塞组D-二聚体水平[（760±152）μg/L]高于无肺栓塞组[（253±56）μg/L]，内皮素-1 的中位数（四分位间距）[5.4 ng/L（1.6～6.9 ng/L）]高于与无肺栓塞组[1.8 ng/L（1.3～4.8）ng/L]，差异均有统计学意义（Z 值分别为-2.946 和-2.532，P＜0.01）。卧床≥7 d、双下肢不等粗≥1 cm 和深静脉血栓形成 是COPD 合并肺栓塞的危险因素（OR 值为2.31～3.24，P＜0.05）。结论：非显性因素所致AECOPD 患者易合并肺栓塞。卧床时间长、双下肢不等粗和深静脉血栓是合并肺栓塞的相关因素。

来源出版物：中华结核和呼吸杂志, 2012, 35(4): 259-263

入选年份：2017

2010—2011年中国肺炎链球菌耐药性 和血清型研究

王启，张菲菲，赵春江，等

摘要：目的：了解我国肺炎链球菌的耐药性和血清型分布，为合理使用抗生素和免疫预防提供依据。方法：收集2010—2011年我国10 个城市13 家医院临床分离的非重复性肺炎链球菌471 株，采用琼脂稀释法测定15 种抗生素的MIC 值；采用简易棋盘式肺炎链球菌分型系统和荚膜肿胀实验进行血清型鉴定。结果：全部菌株中对青霉素耐药（口服折点，MIC≥2 mg/L）的肺炎链球菌（PRSP）占50.1%（236/471）。对左氧氟沙星和莫西沙星的耐药率分别为1.5%（7/471）和0.6%（3/471）。对阿莫西林/克拉维酸、头孢克洛、头孢呋辛和头孢曲松4种β-内酰胺类药物的耐药率分别为27.4%（129/471）、60.3%（284/471）、58.8%（277/471）和18.5%（87/471）。对红霉素、克林霉素、四环素、磺胺甲唑/甲氧苄啶和氯霉素的耐药率分别为93.2%（439/471）、88.7%（417/471）、89.6%（422/471）、62.8%（296/471）和22.1%（104/471）。471 株肺炎链球菌中常见的血清型依次为19F（112，23.8%）、19A（63，13.4%）、3（48，10.2%）、14（43，9.1%）、23F（29，6.2%）、15（25，5.3%）及6A（23，4.9%）。19F 与19A 血清型中PRSP 感染的发生率高达82.1%（100/122）和92.1%（58/63）。7 价和13 价结合疫苗对所有菌株的覆盖率分别为45.3%（213/471）和76.0%（358/471）。儿童中7 价和13 价结合疫苗的覆盖率为59.0%（72/122）和86.9%（106/122），成人中为42.3%（94/222）和73.4%（163/222）。结论：肺炎链球菌对红霉素、克林霉素及四环素耐药严重。血清型19A和19F 耐药严重。7 价和13 价结合疫苗在儿童中的覆盖率均高于成人。13 价结合疫苗可覆盖大部分菌株，特别是PRSP。

来源出版物：中华结核和呼吸杂志, 2013, 36(2): 106-112

入选年份：2017

我国30 个省市城区门诊支气管哮喘患者 控制水平的调查结果

林江涛，顾玉海，袁雅冬，等

摘要：目的：全面评估我国城区支气管哮喘（哮喘）患者控制水平。方法：本研究为多中心横断面研究，采用面对面问卷调查，覆盖我国大陆地区（除西藏外）30 个省市。2015年10月至2016年5月于30 家分中心门诊就诊的符合入选标准的哮喘患者依次入组本研究。问卷内容包括一般资料、控制水平、哮喘管理、哮喘发作的征兆和自我管理、疾病的认知程度。观察指标包括：（1）人口学指标；（2）合并症；（3）控制水平：哮喘控制率、哮喘简易控制测试（ACT）评分；（4）哮喘控制不佳相关事件：过去的一年中因哮喘急性发作住院率、急诊就诊率、误工误学天数及次数。其中，哮喘控制水平依据GINA2015 定义的哮喘控制水平分级，询问在过去4 周中，患者是否具有：出现日间哮喘症状超过2 次/周？任何由哮喘所致的夜间憋醒？需每周超过2 次使用缓解症状药物？具有任何因哮喘所致活动受限情况？4 项均无为控制，1～2 项回答“是”为部分控制，3～4 项回答“是”为未控制。结果：共纳入3875 例门诊哮喘患者。根据GINA 定义的哮喘控制水平分级，我国城区哮喘总体控制率为28.5%（1099/3854）；其中，曾参与2008年哮喘控制调查的10 个城市在本次调查中哮喘控制率为39.2%（533/1361），与2008年（控制率28.7%）比较，有较大程度提高。26.4%（1017 例/3858例）的患者在过去的1年中因哮喘急性发作住院，22.4%（864/3858）的患者在过去的1年中因哮喘发作急诊就诊。在职工作人员中，18.4%（568/3092）的患者在过去的1年中因哮喘发作误工；在校学生中，63.6%（63/99）的患者在过去的1年中因哮喘发作误学。结论：目前我国哮喘总体控制水平尚不理想，但部分城市的哮喘控制水平有明显改善。哮喘控制不佳导致急诊就诊、住院和误工误学增加。

来源出版物：中华结核和呼吸杂志, 2017, 40(7): 494-498

入选年份：2017

成都地区6107 例肺外结核患者结核分枝杆菌 感染与耐药情况

王冬梅，李青峰，朱玛，等

摘要：目的：分析成都地区近年来肺外结核患者MTB的感染及耐药情况，为结核病的防控和诊疗提供依据。方法：回顾性收集分析四川省成都市公共卫生临床医疗中心和成都各个防控督导点2013年1月至2015年12月组织来源为淋巴结、胸膜、腹膜、脑、泌尿系统、骨等肺外结核病例6107 例，其中男4033 例，女2074 例，年龄1～91 岁，平均37 岁。对其流行病学资料、感染和耐药情况采用SPSS 18.0 软件进行统计分析，计数资料统计描述采用百分率（%），计量资料统计描述采用±s 表示。结果：成都地区2013年1月至2015年12月行MTB 培养的21036 例患者中，培养阳性（培阳）7119例（33.8%），其中肺外结核6107 例中阳性896 例，肺外结核培阳病例占全部培阳病例的12.6%（896/7119）。2013—2015年肺外结核培阳病例呈逐年上升趋势，年平均递增率超过50%，病例分布以21～40 岁为主（46.8%，419/896）；男性多于女性，男女比例为2.1∶1，平均年龄34 岁。在淋巴结、胸膜、腹膜、脑膜、泌尿系统、骨和其他类型肺外结核病例中，骨结核病例培养阳性率最高（62/243，25.5%），其次为淋巴结（283/1297，21.8%）、胸膜（289/1840，15.7%）、泌尿系统（63/452，13.9%）、腹膜（41/303，13.5%）、脑膜（156/1915，8.1%）和其他类型结核（2/457，3.5%）；896 例肺外结核病患者分离的MTB 菌株对8 种抗结核药的药物敏感度试验结果显示其耐药性从高到低依次为异烟肼、利福平、链霉素、氧氟沙星、环丙沙星、阿米卡星、卷曲霉素及乙胺丁醇。其耐多药和广泛耐药MTB 的平均分离率分别为9.7%（87/896）和2.0%（17/896）。结论：成都地区近年来肺外结核的标本送检率和阳性检出率均呈逐年上升趋势，耐药率高于国内外研究水平，本地区肺外结核的防控和诊疗工作应进一步受到重视。

来源出版物：中华结核和呼吸杂志, 2017, 40(8): 592-595

入选年份：2017