添加氧载体对γ多聚谷氨酸发酵的影响

冯文心，袁志怡，常忠义，高红亮，贾彩凤

(华东师范大学生命科学学院，上海200241)

γ－多聚谷氨酸(Poly－γ－glutamic acid，γ－PGA)是由L－谷氨酸、D－谷氨酸两种构型的单体，通过γ－酰胺键聚合形成的细胞外水溶性的高分子氨基酸聚合物［1］。γ－PGA具有极佳的成膜性、成纤维性、阻氧性、可塑性、粘结性、保湿性和可生物降解等理化和生物学特性，无毒无害，对人体无任何副作用［2－3］，在医药、食品、塑料以及其它很多方面具有广阔的应用前景［4－5］。

提高γ－PGA的产量一直是实现工业化生产的关键因素。数十年来，人们通过菌种诱变、培养基条件优化、生产工艺条件优化等手段提高γ－PGA的生产效率［6－9］。然而在 γ－PGA 发酵过程中，微生物大量繁殖，对氧气需求量增大，同时伴随着γ－PGA的大量合成，黏度的急剧增加严重阻碍了氧气的传递，较低的溶氧水平是限制γ－PGA产量提高的一个关键因素。因此，提高发酵过程中的溶氧是优化γ－PGA发酵中重要的一步。氧载体是指不溶于培养基但能够吸附或包裹溶解氧，以减少气液传氧阻力，提高氧气传质速率的物质，氧气在其中的溶解度是在水中的15～20 倍［10－11］。近年来，在发酵体系中添加氧载体越来越受到人们的重视。研究表明，利用氧载体对氧气高溶解度的特性，将它们添加到发酵液中，可以降低氧气的传质阻力，显著提高了黄原胶、那他霉素、恩拉霉素的产率［12－14］。另外，在发酵液中添加过氧化氢用来增加发酵液的溶氧，从而提高了 γ－PGA 的产量［15］，但关于 γ－PGA 发酵过程中添加氧载体的研究还鲜有报道。

本文以实验室筛选的枯草芽孢杆菌为材料，从氧载体种类、加入量和加入时间三个方面进行研究，筛选出最优的氧载体加入方式，为实现γ－PGA大规模工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验菌株 本实验室分离并保存的枯草芽孢杆菌;氧载体 正己烷、正庚烷为分析纯 国药集团;正十二烷、正十六烷为分析纯 北京沃凯生物科技有限公司;γ－PGA Sigma公司;种子培养基:胰蛋白胨 10 g/L、酵母粉 5 g/L、NaCl 10 g/L、蒸馏水 1 L，pH7.0;发酵培养基:葡萄糖 50 g/L、L－谷氨酸钠50 g/L、酵母粉 10 g/L、NaCl 10 g/L、KH2PO45 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、蒸馏水 1 L，pH7.0。

Sigma 2－16KL冷冻离心机、QUintix型电子天平(精密度0.1 mg) 塞多利斯科学仪器(北京)有限公司;ZQZY－BF型全温恒温培养摇床 上海知楚仪器有限公司;721型分光光度计 上海光学仪器厂;GNP－9160型隔水式恒温培养箱 上海精宏实验设配有限公司;Synergh－HT酶标仪 基因有限公司;Brookfield粘度计 Brookfield公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 参考文献［16］，将斜面菌种接入5 mL种子培养基中，37℃、250 r/min摇床培养16 h;然后将培养好的种子液以5%的接种量接入装有50 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，37℃、250 r/min摇床培养48 h。

1.2.2 添加氧载体的单因素实验

1.2.2.1 氧载体种类对γ－PGA发酵的影响 发酵开始0 h时，在发酵培养基中分别添加0.5%(与培养基的体积比)的正庚烷、正己烷、正十二烷和正十六烷，对照组不添加氧载体(添加的氧载体量很少，带来的培养基体积变化忽略不计)，发酵结束后，测定发酵液中的γ－PGA产量、菌体生物量(OD600)、发酵液的粘度，综合这些指标，筛选出可以促进γ－PGA产量的氧载体种类。

1.2.2.2 氧载体添加浓度对γ－PGA发酵的影响 在得到最适氧载体种类的基础上，发酵开始0 h时，分别在培养基中以体积比0.1%、0.3%、0.5%、1.0%、2.0%的添加量加入该氧载体，发酵结束后，综合发酵液中的γ－PGA产量、菌体生物量(OD600)和发酵液的粘度，确定氧载体的最佳添加浓度。

1.2.2.3 氧载体添加时间对γ－PGA发酵的影响 在得到最适氧载体种类和最佳添加量的基础上，分别在发酵开始0、12、24、36 h时将最适氧载体以最佳添加浓度的加入培养基，发酵结束后，综合发酵液中的γ－PGA产量、菌体生物量(OD600)和发酵液的粘度，确定氧载体的最佳添加时间。

1.2.2.4 最优氧载体添加方案下γ－PGA摇瓶发酵曲线 在得到最适氧载体种类与其添加方案后，以该方案进行发酵，发酵液每隔6 h取样，测定γ－PGA产量、菌体生物量(OD600)、发酵液残糖含量。

1.2.3 指标的测定

1.2.3.1 发酵液中γ－PGA产量的测定 首先制作γ－PGA标准曲线，参照 Aboy等［17］方法进行测定，步骤如下:在0.2 g/L的NaOH溶液中，加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，配制成5 g/L的CTAB溶液。制备30、50、60、70、90 μg/mL 的 γ－PGA 标准液，分别取100μL不同浓度的γ－PGA标准溶液和100μL CTAB溶液加入96孔板中，其中以不含γ－PGA的蒸馏水作为对照，37℃反应5 min，在酶标仪上测定各孔400 nm处吸光度。根据γ－PGA浓度和OD400吸光值，制作标准曲线。

发酵液中γ－PGA产量的测定:取3.0 mL发酵液，加入9.0 mL预冷无水乙醇，后置于4℃冰箱过夜12 h，10000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用30 mL的蒸馏水充分溶解，再次10000 r/min离心10 min，上清即为待测液，其余操作同标准曲线的操作，根据标准曲线得出发酵液中的发酵液中γ－PGA产量。

1.2.3.2 生物量的测定 取3.0 mL发酵液，用6 mol/L H2SO4调 pH 为3.0，10000 r/min离心10 min，弃上清，菌体沉淀用蒸馏洗涤2次，后将菌体重悬于适量的蒸馏水，测定OD600的吸光值。

1.2.3.3 发酵液粘度的测定 发酵结束后，取50 mL发酵液用粘度计测量，转子为S64型。

1.2.3.4 发酵液中残糖的测定 取1 mL发酵液，用蒸馏水稀释10倍，10000 r/min离心去除菌体，用DNS法［18］测定发酵液中残糖的含量。

1.3 数据处理

实验均重复3次，以珚X±SD表示，采用SPSS 17.0分析数据，采用Graphpad Prism 5和Origin Graph作图。

2 结果与分析

2.1 γ－PGA标准曲线的测定

由不同浓度的γ－PGA标准品与反应液的OD400吸光值，制作标准曲线，结果如图1所示。该曲线R2达到了0.99以上，表明γ－PGA浓度与OD400的相关性良好，可用于测定发酵液中的γ－PGA浓度。

图1 γ－PGA的标准曲线Fig.1 Standard curve ofγ－PGA

2.2 氧载体种类对γ－PGA发酵的影响

由图2A可知，添加正十六烷的实验组的γ－PGA产量显著高于添加正己烷、正庚烷、正十二烷与对照组(p＜0.05)，达到了 18.43 mg/mL，比对照组13.91 mg/mL相比，增加了32%。在对聚谷赖氨酸合成酶的转录表达与动力学研究中指出，胞内ATP水平是 γ－PGA 合成代谢的关键调控因素［18－20］。正十六烷作为氧载体，具有比水较高的溶氧量且与发酵液不相溶，可以减少气－液两相之间的传氧阻力，提高发酵液的溶氧能力，发酵液中溶氧水平的提高，会促进细胞呼吸作用的增强，导致胞内ATP水平的提高，ATP水平的提高，不仅为细胞生产提供了能量，而且有利于聚谷氨酸合成酶催化合成γ－PGA。

图2 不同氧载体对γ－PGA发酵的影响Fig.2 Effect of different oxygen vector on the fermentation ofγ－PGA注:图中不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，图3～图4同。

由图2B可知，添加正十六烷的实验组显示了最高的菌体生物量，OD600达到19.5，对照组为15.6，说明添加正十六烷有利于菌体的生长;而添加正己烷、正庚烷、正十二烷的实验组，菌体生物量(OD600)与对照组相比没有显著性差别(p＞0.05)。

由图2C可知，与对照组相比，添加正十六烷并未显著增加发酵液的粘度(p＞0.05)，此外，添加正己烷、正十六烷、正庚烷的实验组都显示了较高的粘度，可见发酵液的粘度与γ－PGA产量并不完全正相关。综上，选取正十六烷为最优氧载体种类，进行后续实验。

2.3 正十六烷添加量对γ－PGA发酵的影响

由图3A和3B可知，当正十六烷的添加量从0.1%增加到0.5%时，菌体生物量(OD600)逐渐上升，菌体生物量(OD600)从16.3增加到23.91;γ－PGA产量也从13.2 mg/mL增加到18.8 mg/mL。但当正十六烷添加量超过0.5%时，反而不利于菌体的生长与γ－PGA的生成，添加量为1.0%和2.0%时，菌体生物量(OD600)分别为17.37和15.46;此时γ－PGA产量也有所降低，分别为15.22和13.21 mg/mL。正十六烷添加量为0.5%的实验组的γ－PGA产量和菌体生物量(OD600)都显著高于其他浓度的实验组(p＜0.05)。

图3 不同浓度正十六烷对γ－PGA发酵的影响Fig.3 Effect of different amount of n－hexadecane on the fermentation ofγ－PGA

有研究发现［21］，具有正铺展系数的氧载体(如正十六烷)含量的增加会使氧传递系数的数值不断增大，有利于氧的传递，但是，随着正十六烷添加量过高，γ－PGA产量反而逐渐降低，可能是在低装液量、高氧载体浓度时，培养基失水过多，从而影响了γ－PGA的产量。

发酵液粘度主要是由于高聚合度的γ－PGA引起，图3C实验结果表明，粘度的大小与γ－PGA产量并不完全正相关，与上文图2C结论相同，猜测粘度的大小与γ－PGA产量、γ－PGA分子量大小等多重因素有关。粘度仅可以作为γ－PGA产量的一个辅助评价指标。综上，选择0.5%浓度为正十六烷的最优添加量。

2.4 正十六烷的添加时间对γ－PGA发酵的影响

氧载体的添加会增加培养基的溶氧水平，进而影响菌体的生长及代谢水平。因此，氧载体的添加时间对发酵过程有重要影响，实验通过改变正十六烷的添加时间考察其对γ－PGA发酵的影响，结果见图4。

从图4A可知，γ－PGA产量随着氧载体添加时间的延迟而显著降低(p＜0.05)，在0 h添加氧载体的实验组γ－PGA产量最高，为18.48 mg/mL，而在36 h时添加正十六烷时，γ－PGA含量降到13.4 mg/mL。由图4B可知，在0 h添加氧载体时，菌体生物量(OD600nm)显著高于其他添加时间的实验组(p＜0.05)，此时发酵液的菌体生物量(OD600nm)最高，达到了20.9。从图4C可知，随着氧载体添加时间的推迟，发酵液的粘度也均逐渐下降。

图4 正十六烷添加时间对γ－PGA发酵的影响Fig.4 Effect of n－hexadecane addition time on the fermentation ofγ－PGA

可能在发酵后期，菌体处于平台期，外源有机溶剂的添加会对该阶段的细胞生长有一定的抑制作用，进而影响到γ－PGA的合成。小白链霉菌发酵生产ε－聚赖氨酸过程中，发酵初始添加氧载体正十二烷可以显著提高ε－聚赖氨酸的产量［22］;而在茯苓菌深层发酵过程中，48 h添加氧载体，可以最大程度上提高胞外多糖和茯苓酸产量［23］，这可能是由于发酵产物的代谢途径不同所致。综合菌体生物量(OD600)、γ－PGA产量和发酵液粘度的实验结果，选取0 h加入正十六烷为本研究的最佳方案。

2.5 最优氧载体添加方案下γ－PGA摇瓶发酵曲线

由于正十六烷的添加改善了发酵体系的传氧，进而改变整个发酵过程，因此我们考察了在氧载体添加后整个发酵过程中γ－PGA产量、菌体生长及残糖含量的动态变化，结果见图5。

由图5可知，随着发酵的进行，γ－PGA产量、菌体浓度和残糖含量都在动态变化。发酵18 h以前，γ－PGA产量和菌体生物量(OD600)随着发酵的进行都迅速增加，而残糖随之迅速下降，此时微生物生长和发酵产γ－PGA的效率最高。发酵24～48 h期间，残糖含量一直维持在较低水平，说明培养基营养成分基本耗尽，菌体浓度基本维持不变，γ－PGA产量缓慢上升，到发酵48 h时，γ－PGA产量达到最高值为18.62 mg/mL。48 h以后，菌体浓度有所降低，表明此时由于菌体衰老发生了部分自溶，此时的γ－PGA产量也有所下降。研究表明γ－PGA生产菌株在发酵48 h，72 h甚至更长时间 γ－PGA产量达到最高［24－26］。综上，选择 48 h 为最适的发酵周期，此时的γ－PGA产量达到18.62 mg/mL，相比不加氧载体的对照组(13.91 mg/mL)提高了30%以上。

图5 摇瓶中添加氧载体的γ－PGA发酵过程曲线Fig.5 The curve ofγ－PGA fermentation with oxygen vector in shake flask

3 结论

本研究探讨了不同氧载体(包括正己烷、正庚烷、正十二烷、正十六烷)对于枯草芽孢杆菌发酵产γ－PGA的发酵体系中 γ－PGA产量、菌体生物量(OD600)、发酵液粘度的影响，筛选出了最适氧载体(正十六烷)，并对其添加浓度、添加时间进行了优化。通过对氧载体种类、添加量、加入时间的单因素实验，结果表明正十六烷为最适氧载体，其最佳加入条件是发酵0 h时添加0.5%正十六烷。此条件下的发酵曲线表明，48 h时γ－PGA产量达到最高值为18.62 mg/mL，相比对照提高了30%以上，此时发酵液具有较高的粘度。本研究建立了枯草芽孢杆菌发酵产γ－PGA中氧载体的添加策略，使得γ－PGA产量显著提高(p＜0.05)。加入少量正十六烷在有效提高γ－PGA产量的同时保证了其品质，对工业生产有一定应用价值。