一株低产高级醇桑椹果酒酵母的分离、鉴定

孙时光，左 勇，*，张 晶，黄丹丹，张 鑫，秦世蓉，何颂捷

(1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000;2.川北医学院基础医学院，四川南充637000)

桑椹果酒是以桑椹为原料经酵母菌发酵酿制而成的一种具有较高营养价值的低酒精度饮料，桑椹果酒具有补血、强身、益肝、补肾、明目等功效，为果酒中的极品［1－2］。高级醇是指3个碳原子以上的一元醇类，主要包括正丙醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇和苯乙醇等［3］。研究表明，高级醇是桑椹果酒中重要的风味物质，适量的高级醇可以赋予桑椹果酒特殊的风味和香气，若桑椹果酒中高级醇含量过少则酒体风味淡薄，若高级醇含量过高则会给桑椹果酒带来异味，并容易让饮酒者感到头疼和醉酒，因此需控制好桑椹果酒中高级醇的含量［4］。

目前，果酒酿造的酵母多数采用葡萄酒酿酒酵母，由于葡萄汁与桑椹果汁成分有明显的差异，以葡萄酒酿酒酵母酿造出的桑椹果酒在香气、味道、口感和色泽方面均有缺陷［5］。因此，采用适合酿造桑椹果酒的专用酵母进行桑椹果酒的酿造，是解决这一问题的关键。本研究拟从桑椹自然发酵液中分离筛选适合桑椹果酒发酵的优良酵母，用于桑椹果酒纯种发酵，从而提高桑椹果酒品质和降低桑椹果酒中高级醇的含量。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株来源 自然发酵的桑椹发酵液;法国诺盟葡萄酒酵母 购于日照隆堡商贸有限公司;安琪葡萄酒酵母 购于湖北安琪酵母股份有限公司;白砂糖 市售一级白砂糖;YPD富集培养基:葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母膏10 g/L;YPD固体培养基与斜面保藏培养基:在YPD富集培养基基础上加入琼脂20 g/L，灭菌后倒入培养皿或试管;桑椹汁培养基:解冻后现榨的桑椹汁，用白砂糖调整糖度至21 Brix;正丙醇、异丁醇、异戊醇、乙醇、乙酸丁酯 成都科隆化学品有限公司;酵母基因组DNA提取试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司。

JYZ－E25九阳原汁机 九阳股份有限公司;PH100－2A41L－EP生物显微镜 凤凰光学股份有限公司;SKY－2102C恒温培养振荡器 上海苏坤实业有限公司;YXQ－LS－75SII立式压力蒸汽灭菌器 上海博讯实业有限公司;Agilent 6890N－5975B气相色谱仪 美国Agilent公司;TG－16医用离心机 四川蜀科仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种分离 选择成熟健康无霉变桑椹果破碎打浆，放入三角瓶中于25℃自然发酵，待三角瓶中有大量气泡产生时，将一定量发酵醪接入YPD富集培养基，25℃恒温振荡培养2～3 d。将富集好的菌悬液用无菌的YPD固体培养基平板涂布分离，25℃培养2 d。从培养好的平板上选取有典型酵母形态的单菌落，在YPD培养基平板上进行划线分离纯化并镜检，将所得单菌落转接到YPD斜面培养基于4℃保存并进行编号命名。

1.2.2 酵母菌的筛选 酵母菌的初筛:将活化好的酵母以5%的接种量接种到无菌桑椹汁培养基中，采用杜氏管发酵法［6］观察各菌株的产气速度和产气量，并比较各菌株的发酵气味。

酵母菌的复筛:将初筛所得发酵力强且气味较好的菌株活化后按5%的接种量接种于桑椹汁培养基中，25℃无氧发酵7 d。测定发酵液的乙醇体积分数，并对其进行粗略的感官品评。

酵母菌的三级筛选:酵母菌耐乙醇能力的筛选:采用杜氏管发酵法，调整桑椹汁培养基中乙醇含量为8%、10%、12%、14%，接种量为5%，25℃发酵48 h，观察杜氏管中起泡情况;酵母菌耐SO2能力的筛选:采用杜氏管发酵法，调整桑椹汁培养基SO2浓度为60、80、100、120 mg/L，接种量为5%，25 ℃发酵48 h，观察杜氏管中起泡情况。

1.2.3 菌株发酵力的对比分析 将表现良好的菌株与法国诺盟葡萄酒酵母和安琪葡萄酒酵母做对比，按照5%的接种量分别接种于桑椹汁培养基中，25℃恒温无氧条件下发酵7 d。检测发酵结束后的发酵液乙醇、残糖、总酸和挥发酸含量，并对酒体的色泽和气味做出感官评价［7］。

1.2.4 高级醇含量的对比 各菌株发酵结束后，进行高级醇检测，对比主要高级醇的含量与总高级醇的含量。

取内标乙酸正丁酯标准溶液0.1 mL于10 mL容量瓶中，取待测酒样进行定容，混匀后过滤膜除杂质，取1.5 mL处理后的酒样加入到自动进样瓶中，上机。根据保留时间定性，峰面积内标法进行定量。

1.2.5 菌株的鉴定 取斜面保藏的菌株，接种于YPD液体培养基中，25℃、150 r/min培养24 h。取适量培养液离心1 min(12000 r/min，4℃)，弃上清液，得到适量菌体，用酵母基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。用酵母ITS区通用引物对正向引物ITS1、反向引物ITS4扩增基因组DNA，反应条件为:94℃预变性5 min后进入以下循环:94℃变性45 s，55 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 60 s，35 个循环;72℃延伸10 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。产物送往测序公司测序［8］。测序所得结果上传到美国国家生物技术信息中心(national center of biotechnology information，NCBI)数据库中，使用局部比对搜索工具(basic local alignmentsearch tool，BLAST)比对，下载同源性高的基因序列。将所有序列导入MEGA7.0软件构建系统进化树［9］。

1.3 分析方法

1.3.1 乙醇体积分数的测定 采用分光光度计法［10］测定发酵液中乙醇体积分数。

1.3.2 还原糖、总酸和挥发酸含量的测定 参照GB/T 15038－2006 葡萄酒、果酒通用分析方法［11］测定发酵液中还原糖、总酸和挥发酸含量。

1.3.3 感官品评 采用左勇［12］等制定的感官评分标准(表1)，组织经过感官品评培训的专业人员对每批桑椹果酒进行感官品评，结果取平均值。

1.3.4 气相色谱法测定高级醇 色谱条件:毛细管柱J＆W 122－7062 DB－WAX 60.0 m ×0.25 mm ×0.25 μm;进样口温度230℃，起始温度45℃，保留2 min，以4℃/min升至120℃，保留2 min，以10℃/min升至230℃，保留3 min;载气He，检测器温度230℃，恒流 1.0 mL/min;进样量:2 μL［13］。

1.4 数据处理

每组试验设3次平行，试验结果均以珋x±sd表示，应用SPSS 22软件对不同酵母发酵的桑椹果酒的各个指标进行显著性差异分析，应用Origin 9.0软件对各酵母的高级醇产量作图，应用MEGA 7软件绘制S－2菌株基于18S rRNA序列的系统进化树。

2 结果与分析

2.1 菌种分离

从桑椹自然发酵液中共分离出35株菌种，这些菌种的形态大体相同，以图1的菌种形态为代表。从图1中可以看出这些菌株的菌落表面光滑、湿润、黏稠，质地均匀柔软，正面与反面以及边缘与中央部位的颜色较一致，为乳白色，易挑起，有酒香味，符合酵母菌的特征［14－15］。初步镜检发现(图 2)，细胞形态呈卵圆状，无色透明;繁殖时期的母细胞生出小突起，为芽体(芽孢子)，经核分裂后，一个子核移入芽体中，芽体长大后与母细胞分离，单独成为新个体，此繁殖方式为出芽繁殖，符合酵母细胞的特征。

表1 桑椹果酒的感官评分标准Table 1 The scoring criteria for sensory evaluation of mulberry wine

图1 YPD平板上菌落形态Fig.1 Colony morphology on the YPD tablet

图2 10×40倍显微镜下细胞形态Fig.2 Cell morphology under 10×40 times microscope注:上图显示显微镜下细胞繁殖时期的分裂状态，下图显示显微镜下单个酵母细胞的形态。

2.2 酵母菌的初筛

从酵母菌的初筛结果(表2)可以看出，12 h有10株菌种开始产气，说明这些菌种的起酵速度快;24 h超过半数的菌种开始产气，并且有些菌株的产气量超过了杜氏小管的2/3，说明从自然发酵醪液中分离出的大部分菌种的起酵速度已经符合果酒发酵的要求;36 h有14株菌种的产气量已经充满了整个杜氏小管，说明这14株菌种生长良好，具有优良的发酵能力;48 h大多数酵母的杜氏小管内都充满了气泡，说明这些菌株发酵能力强。摇动大多数试管可闻到淡淡的酒香，说明这些菌株是较好的果酒发酵菌株。产气充裕的菌株有33株，发酵气味优良的菌株有17株。其中，发酵能力强且发酵气味愉悦的共有16株。

表2 酵母初筛结果Table 2 Results of yeasts initial screening

2.3 酵母菌的复筛

通过对初筛后的菌种进行产乙醇能力测试，由结果可知(表3)，产生乙醇含量超过10%的菌株有7株，未超过10%但大于9%的菌株有7株，小于9%的菌株仅有2株。然而产乙醇含量超过9%的菌株中有两株产生了腐败味，最终保留12株产乙醇含量超过9%且无异味的菌株。

表3 酵母产乙醇能力筛选Table 3 Alcohol production capacity screening of the yeasts

2.4 酵母菌的三级筛选

2.4.1 耐乙醇能力的筛选 在果汁培养基中添加高浓度的乙醇，可以筛选出能耐高浓度乙醇的菌株。本实验中酵母对乙醇的耐受性如表4所示，复筛所得到的12株菌种都能在8%的乙醇环境中生长并在杜氏管中充满气泡。其中10株在10%的乙醇环境下依然产生大量的气泡。当乙醇含量增长到12%时，还有8株菌可以生长，虽然气泡没有低浓度乙醇环境下多，但相比其它菌株产生的气泡依然较多，说明这8株菌是能够耐12%乙醇含量的优良菌株。最后在含14%乙醇的环境中还有4株菌可以生存并能产生气泡，说明这是极好的耐高乙醇含量的优势菌株。此轮筛选保留能够耐12%乙醇含量的8株菌(包含耐14%乙醇含量的4株)。

表4 酵母菌对乙醇耐受性筛选Table 4 Alcohol tolerance ability screening of different yeasts

2.4.2 耐SO2能力的筛选 通常在果酒发酵前加入适量的SO2，可减少其他微生物对酿酒酵母的影响，确保发酵顺利完成［16］。本实验通过添加偏重亚硫酸钾来调节桑椹汁中SO2的浓度，实验结果(表5)显示，经过乙醇耐受性筛选所得的酵母菌在SO2最大实验添加量下都生长旺盛，并且考虑到实际发酵时SO2浓度一般为40～80 mg/L，此轮筛选保留所有菌株［9］。

表5 酵母菌对SO2耐受性筛选Table 5 SO2 tolerance ability screening of different yeasts

2.5 菌株发酵力的对比分析

将筛选出的8株菌株与法国诺盟葡萄酒酵母和安琪葡萄酒酵母分别接入桑椹汁培养基中进行发酵，检测发酵结束后发酵液的乙醇体积分数、残糖、总酸和挥发酸含量，并对酒体进行感官评价，结果如表6所示。

表6 十二种桑椹酒的各指标分析结果Table 6 Index analysis results of twelve mulberry wines

从表6可以看出，各菌株对糖的利用都比较完全，残糖全都小于10 g/L，说明全部菌株都能正常发酵，其中S－8菌株的残糖最低，为7.29 g/L，发酵最完全。不同菌株发酵液的乙醇体积分数相差较大，其中有三株菌种的乙醇含量未达到10%，与其他菌株乙醇含量有显著性差异(p＜0.05)，乙醇含量最高的是S－8号菌株，为11.25%，已经充分的将葡萄糖转化为乙醇。各菌株的总酸和挥发酸的含量均符合NY/T 1508－2017［17］对果酒中总酸(4.0～9.0 g/L) 和挥发酸(≤1.0 g/L)含量的要求，只有法国诺盟葡萄酒酵母的挥发酸含量超标。通过筛选结果表明，菌株 S－2、S－3、S－8、S－9、S－26 产乙醇含量均在10%以上，显著(p＜0.05)高于对照菌株的产乙醇含量，且上述五种菌株产生的总酸和挥发酸含量较低，剩余的残糖含量较低，感官评分较高，均是优良的桑椹果酒酵母，适合桑椹果酒的酿造。

2.6 高级醇含量的对比

通过测定各菌株发酵结束后发酵液中的高级醇产生量，做出各菌株高级醇产生量的对比图，结果如图3。

图3 各酵母菌株高级醇的产生量(mg/L)Fig.3 Production of higher alcohols by yeast strains(mg/L)注:不同字母表示差异显著(p＜0.05)。

桑椹果酒中的高级醇主要包括正丙醇、异丁醇和异戊醇三种，其中异戊醇所占比例较高。有研究表明在葡萄酒中总的高级醇含量在80～540 mg/L之间，含量达300 mg/L时便可产生令人愉快的风味，但是当含量在400 mg/L以上时，会产生不愉快的风味，而异戊醇会给果酒带来不良的风味［18］。在这8株菌种中，异戊醇和总高级醇含量最低的是S－2号菌株，其异戊醇和总高级醇含量与其它菌株均呈显著性差异(p＜0.05)。S－2号菌株的总高级醇含量为312.41 mg/L，符合本次实验所选菌株的要求。

2.7 菌种鉴定

如图4所示，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。S－2菌株18S rRNA序列在BLAST中的比对结果表明，该菌与酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)18S rDNA序列同源性最高，相似度达到100%。使用MEGA 7.0软件对与S－2号菌株相似度较高的菌株进行多序列比对分析，并利用Neighbor－Joining方法制作基因系统进化树。由图5可知，S－2号菌株与酿酒酵母同源性最高，初步鉴定为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

图4 酵母PCR产物琼脂糖电泳图Fig.4 PCR products by agarose electrophoresis of yeast注:M:DL2000 DNA ladder;1:样品。

图5 S－2菌株基于18SrRNA序列的系统进化树Fig.5 Phylogenetic tree of strains S－2 based on 18SrRNA sequence

3 结论

本研究从桑椹自然发酵液中共分离出35株菌种，通过杜氏小管发酵法初筛，产乙醇能力复筛，耐乙醇和SO2能力三级筛选，得到8株产气能力较强、产乙醇含量较高、耐受性较好的酵母菌。用这8株发酵能力较好的菌种与对照菌株分别发酵桑椹果汁，比较菌种的发酵性能和高级醇产量，得到1株发酵性能优良且高级醇产生量低的酿酒酵母—S－2。对S－2菌种进行的研究表明，该菌起酵快、产气充足，有很强的耐受性，发酵能力强，产乙醇含量高达10.56%，且高级醇产生量低，为312.41 mg/L。说明该菌完全可以取代葡萄酒活性干酵母用于桑椹果酒的发酵，也说明桑椹表皮含有的菌种可以满足甚至更适合桑椹果酒的酿造。