巨菌草根内生固氮菌Klebsiella variicola的分离、鉴定及培养条件的优化

林标声, 汪丽芳, 宋昭昭, 贾雨雷, 林占熺

(1.龙岩学院生命科学学院,福建 龙岩 364012；2.福建农林大学生命科学学院,福建 福州 350002；3.国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002)

植物内生固氮菌(Endophyticdiazotroph)是指那些定殖在健康植物体内,与宿主植物进行联合固氮的一类微生物.根据菌体是否能够定殖于植物组织内部，固氮菌可分为根际固氮菌和内生固氮菌[1].目前已从许多禾本科植物，如甘蔗、水稻、玉米、高粱及牧草等分离得到内生固氮菌，如固氮螺菌(Azospirillum)[2]、阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)[3]、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)[4]、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella.peneumoniae)[5]等.20世纪80年代以来，内生固氮菌由于在禾本科作物上具有较强的固氮活性，又能促进植物生长及防治植物病害，成为联合固氮研究领域的热点[6-7].至今未有关于巨菌草联合固氮菌的研究报道.

巨菌草(Pennisetumsp.)为多年生禾本科牧草，隶属于狼尾草属，具有直立、丛生、适应性强、耐多次刈割、产草量高等特点.巨菌草根系发达，主根明显，肉质粗壮，入土深，可达3～4 m；侧根发达，横向分布可达2.0～2.5 m，抗旱性极强[8].巨菌草目前在内蒙古、青海、宁夏等土地贫瘠的沙漠、流动沙丘等地种植，种植后沙地有机质、酶活性及微生物数量明显增加.经测定，在荒坡地种植巨菌草在一定程度上能提高土壤碱解氮、有效磷、速效钾的含量，这很可能是巨菌草内生固氮菌在起作用[9].本研究利用无氮培养基对巨菌草成熟期根部进行了内生固氮菌的分离与筛选、鉴定，选定其中丰度最高、酶活性最强的菌株作为研究对象，对其进行形态、生理生化及16S rDNA序列鉴定，并对其进行发酵条件的优化，以期为将来巨菌草内生固氮菌的资源开发及其固氮菌肥研制提供依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

在福建农林大学旗山校区菌草研究所试验基地采集巨菌草的根.材料采集后立即清洗干净，装入无菌封口塑料袋，带回实验室处理.

1.2 培养基

Ashby无氮培养基：10 g·L-1甘露醇、0.2 g·L-1磷酸二氢钾 、0.2 g·L-1七水硫酸镁、 0.2 g·L-1氯化钠、0.1 g·L-1硫酸钙和5.0 g·L-1碳酸钙，pH 7.0～7.2.

Nfb无氮培养基：5 g·L-1苹果酸、 4.5 g·L-1氢氧化钾、 0.5 g·L-1磷酸氢二钾、 0.2 g·L-1七水硫酸镁、0.02 g·L-1氯化钙、0.1 g·L-1氯化钠、2 mL溴百里酚蓝(0.5%溶解于0.2N KOH中)、 4 mL EDTA、1 mL维生素( 200 mg·L-1VBe，100 mg·L-1生物素)，以及2 mL微量元素(0.4 g硫酸铜 + 0.12 g硫酸锌+31.4 g硼酸+1 g钼酸钠+1.5 g硫酸锰)，pH 6.8～7.0.

肺炎克雷伯氏菌培养基[10](KP培养基)：20 g·L-1蔗糖、 32 g·L-1Na2HPO4、0.5 g·L-1酵母粉、 0.68 g·L-1KH2PO4、36 mg·L-1柠檬酸铁、 26 mg·L-1CaCl2·2H2O、 0.3 mg·L-1MnSO4和 7.6 mg·L-1Na2MoO4·2H2O，pH 7.0～7.2.

1.3 方法

1.3.1 材料消毒 挑选无病变、品相良好的巨菌草根5～10 g，先用流水冲洗1～2 h，再采用75%(体积分数)乙醇、2%(体积分数)次氯酸钠、无菌水依次洗涤.75%(体积分数)乙醇浸泡60 s，2%(体积分数)次氯酸钠处理15～20 min，进行表面灭菌，无菌水再冲洗4次.采用稀释涂布法，将最后一次的无菌水洗涤液涂布于LB培养基中，30 ℃培养1～2 d，以无菌在LB培养基上生长为消毒合格.

1.3.2 内生固氮菌的分离、筛选 将表面消毒完全的材料放入灭菌后的研钵中，用无菌剪刀剪碎后再加入适量PBS缓冲液研磨，取其汁液0.1 mL涂布在Ashby固体培养基平板上，28～30 ℃倒置培养2～3 d，观察菌落生长情况；将长出的单菌接种于Nfb固体培养基中进行复筛；将能在Nfb培养基上生长且培养基颜色由蓝色变成绿色的菌株挑出，再次接种于Ashby固体培养基上，反复3次；最后将所筛选出的菌落接种于Ashby斜面培养基上，保存待用.观察所分离菌株的菌落形态，进行固氮酶活性测定，选定分离比例较高且固氮酶活性高的菌株作为高效固氮菌的目的菌株，重复3次.

固氮酶活性测定：采用细菌固氮酶ELISA试剂盒和瑞士帝肯Tecan Sunrise F50酶标仪测定.试剂盒购自上海羽朵生物科技有限公司.

1.3.3 所筛选菌株的显微形态、生理生化及16S rDNA序列分析 对所分离的高效固氮菌株进行光学显微镜下的形态观察，并进行生理生化鉴定和16S rDNA序列分析[11].生理生化鉴定参照文献[12].

16S rDNA 序列分析：提取纯化细菌总DNA，设计PCR引物.F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′.R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′.PCR反应总体系25 μL，其中PCR TaqMix(2×Tag)12.5 μL，模板DNA 1 μL，PrimerF(10 μmoL·L-1) 0.2 μL，PrimerR(10 μmoL·L-1)0.2 μL，H2O 8.6 μL.PCR程序为：94 ℃5 min，94 ℃1 min，60 ℃1 min，72 ℃1 min，30个循环后72 ℃延伸5 min.琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物片段，经凝胶回收纯化后送铂尚生物技术(上海)有限公司测序.测序所得的16S rDNA序列在NCBI 数据库进行比对，下载相近菌株的序列信息，按照软件 Mega6 重新构建系统发育进化树，分析菌株的分类学地位.

1.3.4 所筛选菌株的生长曲线和代时 所筛选的高效固氮菌经Ashby无氮培养基固体平板活化后，分别接入液体Ashby无氮培养基和KP有氮培养基中，28～30 ℃下200 r·min-1振荡培养，每4 h取样，测定其菌体生长量D600 nm，绘制生长曲线.分别在对数生长期初始和末期各取菌液1 mL，梯度稀释后接入固体平板中培养，活菌计数，计算菌株在不同培养基条件下的代时(G).G=0.30(t2-t1)/(lgx2-lgx1)，其中t1、t2为对数生长初始和末期的时间(h)；x1、x2为对数生长初始和末期取样时的活菌总数.试验重复3次.

1.3.5 所筛选菌株培养条件的优化 将所筛选的高效固氮菌经液体Ashby无氮培养基培养至对数期后，按设定的接种量接入250 mL KP液体培养基中培养.根据预试验结果，选定8个因素进行Plackett-Burman试验设计(表1)，以菌体生长量D600 nm为响应值筛选出影响培养效果的显著因素做进一步的Box-Behnken响应面优化试验，确定适合菌株培养的最优工艺条件，并进行最佳工艺条件下的验证性试验.试验重复3次，取均值.

表1 Plackett-Burman试验设计Table 1 Plackett-Burman experimental design

2 结果与分析

2.1 巨菌草根部内生固氮菌的分离、筛选及鉴定

巨菌草根部内生固氮菌经Ashby无氮培养的分离，筛选，得到了112个菌落，其中5种类型菌落酶活性较高，且菌落形态符合固氮菌基本特性.菌株GN02在各菌落中所占比例最高，固氮酶活性较高，因此初步选定其作为高效固氮菌(表2).

表2 筛选菌株的菌落形态和固氮酶活性1)Table 2 Colonial morphology and nitrogenase activity of the screened strains

1)同一列数字后相同字母表示差异不显著(P<0.05)，不同字母表示差异显著(P>0.05).

图1 固氮菌GN02的16s rDNA电泳图Fig.1 Electrophoresis of diazotrophs GDN2 16s rDNA

显微镜下，GN02菌株革兰式阴性，较粗，短杆状，大小(0.5～0.8)μm×(1～2)μm，单独、成双或短链状排列；无芽孢，有菌毛和荚膜，荚膜较厚，但无鞭毛，不运动.生理生化鉴定结果表明：该菌株能利用葡萄糖、乳糖和枸橼酸；经硝酸盐还原试验、VP试验、丙二酸盐试验、柠檬酸盐试验和脲酶试验呈阳性，经氧化酶试验、吲哚试验和甲基红试验呈阴性.

菌株GN02扩增出的16S rDNA片断条带单一(图1)，经测序得到长度约1.6 kb的序列.将此序列与GenBank中已发表的16S rDNA序列进行同源性比较(图2)，选取NCBI数据库中同源性在95%以上的相关菌株构建NJ进化树，可知菌株GN02与克雷伯菌属(Klebsiella)的几个菌株的亲源关系最近，相似性均达99%以上.综合菌株GN02的形态特征、生理生化特征以及l6S rDNA序列分析结果，将其初步鉴定为变栖克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola).

图2 固氮菌GN02的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of diazotrophs GN02

2.2 固氮菌GN02的生长性能

固氮菌GN02在Ashby无氮培养基和KP有氮培养基中的生长曲线如图3所示.固氮菌GN02在Ashby无氮培养基中进入对数生长期的时间为20 h，经平板活菌计数其G为0.8～1.2 h；而在KP有氮培养基中进入对数生长期的时间为8 h，G为2.5～2.8 h.整体上，固氮菌GN02在KP有氮培养基中菌体量的D600 nm略高，且其稳定期更长.结果表明，固氮菌GN02在有氮源提供的情况下，生长速度更快，菌体量更多，且能够保持更长时间.

图3 菌株GN02在Ashby无氮培养基和KP有氮培养基中的生长曲线Fig.3 The growth curve of the strain GN02 in Ashby nitrogen-free medium and KP nitrogen medium

2.3 响应面法优化固氮菌GN02菌体的生长条件

2.3.1 影响固氮菌GN02菌体生长关键因素的筛选 采用Minitab 15软件对表1的Plackett-Burman试验设计进行分析，结果(表3、4)表明：影响固氮菌GN02菌体生长关键因素的重要性依次排序是：温度(X3)>pH(X2)>蔗糖(X9)>培养时间(X5)>转速(X6)>装液量(X7)>接种量(X4)>酵母粉(X8).其中，温度(X3)、pH(X2)和蔗糖(X7)对响应值影响达到了显著水平，因此选定此3个因素进行响应面分析.

2.3.2 固氮菌GN02最优培养条件的确定 以固氮菌GN02菌体生长D600 nm为响应值进行Box-Benhnken设计，三因素三水平的响应面设计及试验结果如表5所示.利用Design-Expert 7.0软件对响应值进行回归分析，得到的响应值D600 nm和各因素变量之间的二元回归方程为：R=+1.44+0.041×A+0.032×B+3.750×10-3×C+7.500×10-3×A×B-5.000×10-3×A×C+0.018×B×C-0.037×A2-0.034×B2-0.042×C2.

表3 Plackett-Burman试验设计及响应值Table 3 Design and response values of Plackett-Burman experiments

表4 8个因素的显著性分析Table 4 Analysis of the significance of the eight factors

表5 三因素Box-Benhnken试验设计安排与结果Table 5 Design and results of Box-Benhnken experiments on the three factors

该回归模型的方差分析结果(表6)表明该模型具有统计学意义(P<0.05，显著).其中失拟项不显著(P>0.05)，表明回归方程误差小，拟合情况好，能真实反映各因素与响应值之间的相互关系.各因素方差分析结果表明，对响应值D600 nm影响大小的依次顺序为：温度(A)>pH(B)>蔗糖(C)，其中温度(A)和pH(B)对响应值影响显著(P<0.05).

表6 回归模型的方差分析结果Table 6 Variance analysis and results of regression model

各因素响应面曲面分析结果如图4所示，根据所得的模型可预测，固氮菌GN02菌体生长的最佳工艺条件为：温度37.1 ℃，pH 5.6，蔗糖25.6 g·L-1.在该条件下D600 nm能达到1.47.按上述的最优工艺条件进行验证性试验，重复3次，D600 nm均值为1.48，与理论预测值(1.47)相近，重复性好，且比优化前Plackett-Burman试验设计的D600 nm值(1.21)提高了22.31%.

图4 3个因素交互作用的响应曲面图Fig.4 Response surface plots for the effects of cross-interactions among three factors

3 小结与讨论

固氮菌由于自身的生长特性能在无氮培养基中生长，因此常利用无氮培养基来富集、分离固氮菌[13].本试验选定Ashby和Nfb无氮培养基作为选择性培养基，从巨菌草成熟期根部分离得到1株具有高效固氮性能的内生固氮菌GN02，初步鉴定其为变栖克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola).KP培养基是实验室内肺炎克雷伯氏菌常用的生长培养基[14]，因此选定KP培养基作为所分离菌株的生长培养基，研究其培养条件.结果表明，所分离的固氮菌株GN02在有氮源提供的KP培养基中，其生长速度、菌体量和稳定期维持时间均明显优于无氮源提供的Ashby培养基.

目前，国内关于禾本科植物内生固氮菌的报道主要来自甘蔗、玉米和水稻[15-17]，还未有巨菌草的相关报道.本研究首次从巨菌草中分离得到了高丰度、高固氮性能的内生固氮菌变栖克雷伯氏菌(Klebsiellavariicola)，与来自其他禾本科植物的克雷伯氏菌属菌株具有较好的同源性，表明克雷伯氏菌属可能是禾本科植物的重要内生固氮菌，在禾本科植物的联合固氮中能起到重要的作用[18].