哮喘患者血浆ADMA与MTP、ATP、SDH及细胞色素氧化酶活性的相关性*

李茂林， 蒋秀园， 顾茜娜

(宜兴市肿瘤医院 检验科， 江苏 宜兴 214200)

支气管哮喘(简称哮喘)属于一种异质性的疾病，其病理特征是慢性气道炎症。炎性介质会导致炎性细胞聚集以及活化，临床表现为不同程度的气道高反应性、气道阻塞、过量的黏液分泌以及免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)水平升高[1-2]，哮喘的发病率以及病死率逐渐上升[3-5]。哮喘患者无论是急性发作期还是缓解期，都会出现机体活性氧增加以及氧化或抗氧化失去平衡，氧化应激反应会对哮喘的发生发展起到直接的促进效果[7-9]。线粒体功能障碍会诱发活性氧增加、引发哮喘发病或加重[10- 11]；二甲基精氨酸(dimethylarginine，ADMA)是一种内源性的一氧化氮合酶(nitricoxide synthase，NOS)抑制剂，可以与左旋-精氨酸(L-Arg)及NOS结合，从而使一氧化氮(nitric oxide，NO)生成量变少[12]，从而干预体内氧化应激水平。本研究分析哮喘急性发作患者血浆ADMA水平与线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential，MTP)、腺苷三磷酸(adenosine triphosphoric acid，ATP)、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase，SDH)及细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，COX)活性的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月～2018年2月哮喘急性发作患者30例作为哮喘组，男17例、女13例，平均(31.52±3.09)岁；其中12例为病情轻度组、18例为病情中度组，病程1周～40年；8例有激素应用史。另选取正常体检人群30例作为对照组，男19例、女11例，平均(31.99±3.23)岁。哮喘急性发作患者入选标准：符合中华医学会呼吸病学分会发布的《支气管哮喘防治指南》中的支气管哮喘急性发作期诊断标准[3]。哮喘急性发作患者排除标准：(1)支气管哮喘缓解期患者，(2)支气管哮喘病情严重度Ⅳ级患者，(3)上呼吸道以及气管、支气管内肿瘤，心源性哮喘或其他能够导致哮喘的器质性疾病患者，(4)已经进行其他有关治疗，可能对本研究的效应指标观测造成影响的患者，(5)合并有心、肝、肾以及造血系统等危及生命的原发性疾病及精神病患者，(6)不能配合系统治疗、对疗效无法判断 或者资料不全对疗效和安全性造成影响的患者。

1.2 方法

1.2.1分组 哮喘急性发作患者30例为哮喘组，同期正常体检者30例为对照组，两组患者性别、年龄和体质量比较差异无统计学意义，具有可比性。见表1。

表1 两组受试者一般资料比较(n=30)Tab.1 Comparison of general data in the two groups of patients

1.2.2血浆ADMA水平 两组患者入院后次日晨起空腹采集外周血50 mL。将l mL血浆添加5-磺基杨酸沉淀蛋白，离心后取出10 μL血浆样本添加100 μL/min为流速，通过柱处理后采取MS-2010 高效液相质谱仪测定ADMA含量。

1.2.3血小板线粒体ATP水平 两组患者入院后次日晨起空腹采集外周血50 mL。将5 mL血浆在4 ℃ 的条件下进行12 000 r/min离心5～10 min，取中间层，在避光条件下取闪烁杯将其标记成标准管和测定管，并添加100 μL荧光素酶ATP检测工作液，使用裂解液将ATP标准溶液稀释成不同浓度，将其快速混匀，间隔至少2 s后，采用液闪仪和酶标仪检测各标准管单位时间转化底物数(CPM)和相对光单位(relative light unit，RLU)值，绘制标准曲线，用考马斯亮兰试剂盒检测蛋白含量。

1.2.4血小板MTP 取0.1 μmol/L罗丹明123添加反应介质，反应介质包含7 mmol/L MgCl2、150 nmol/L蔗糖、30 mmol/L KOH-HE PES、5 mmol/L K2HP04，pH为7.0～8.0，在37 ℃条件下用荧光分光光度计测定血小板线粒体荧光值。

1.2.5血小板线粒体COX 取10 μL的线粒体悬液，添加到具有亚铁细胞色素C的反应底物中，在550 nm处测定亚铁细胞色素C吸光度值。

1.2.6线粒体SDH的活性 将100 μL线粒体悬液放置到清洗完毕的比色皿，添加反应底物以及辅助因子等试剂，5 s时在600 nm处测定吸光度OD1值，1 min后对吸光度OD2值进行测定，计算线粒体悬液中琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性。

1.2.7NO含量测定 抽取血浆5 mL，在在3 000 r/min离心10 min，测定管取血浆的上清0.5 mL，标准管取10 μmol/L的标准应用液0.1 mL与双蒸水0.4 mL进行混合，充分旋涡混匀30 s，在室温的条件下静置40 min后，3 500～5 000 r/min离心10 min， 抽取上清0.8 mL添加显色剂0.6 mL，进行混合摇匀，在室温条件下静置10 min，使用蒸馏水进行调零，采取分光光度计在550 nm处对每管的光密度值进行测定。

1.2.8NOS活性测定 测定管放置10%的血浆5 mL，空白管放置双蒸水50 μL，每管添加底物200 μL缓冲液、10 μ L促进剂及100 μL显色剂，混合均匀后放置在37 ℃水浴准确反应15 min，取出后添加100 μL透明剂和2 mL终止液， 混合均匀后，采用分光光度计在530 nm处测定光密度值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 血浆ADMA浓度

哮喘组患者血浆ADMA浓度为(1.53±0.61)mmol/L，较对照组(3.27±0.95)mmol/L降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 线粒体功能

哮喘组患者线粒体MTP、ATP、COX及SDH变化与对照组比较均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 哮喘组患者与对照组线粒体MTP、ATP、COX及Tab.2 MTP, ATP, COX and SDH of asthma group and control group

2.3 NOS活性、NO含量

哮喘组患者NOS活性、NO含量变化与对照组比较，NO生成明显减少，NOS活性明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。 见表3。

表3 哮喘组患者与对照组血浆NOS活性、NO含量变化Tab.3 Plasma NOS activity and NO levels of asthma group and control group

2.4 相关性

对哮喘组患者血浆ADMA浓度与线粒体SDH、 COX、MTP及ATP含量进行线性相关分析表明，哮喘组血浆ADMA浓度与反映线粒体功能的4个指标(SDH、 COX、MTP、ATP)均呈负相关，ADMA与线粒体SDH的r=-0.61、P=0.001，ADMA与线粒体COX的r=-0.69、P=0.000，ADMA与线粒体MTP的r=-0.65、P=0.000，ADMA与线粒体 ATP含量的r=-0.41、P=0.039；皮尔逊相关系数均具有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

支气管哮喘属于一类气道结构上发生的病变，而不仅仅是气道功能出现的紊乱，类气道结构发生的紊乱。哮喘的发病机制为支气管平滑肌痉挛，不同严重程度或者不同病期的哮喘患者多有气道炎症的存在[13-14]。哮喘慢性气道炎症学说的成立给支气管哮喘的治疗造成了完全的改变，从对解痊平喘进行控制从而转变为对气道炎症进行控制的抗炎治疗[15]。哮喘急性发作的主要特征是喘息、气急、咳嗽以及胸闷等，其主要特征是患者的呼吸发生困难，呼气流量突然变弱，该症状主要因为长期接触变应原等刺激物或者治疗手段不合适等所引发[16]。哮喘患者无论是急性发作期或者是缓解期都具有机体活性氧变多以及氧化/抗氧化失去平衡，氧化应激反应对哮喘的发生发展具有明显的促进效果。细胞代谢和免疫功能在疾病的发生发展的机制中发挥关键作用[17]。不对称ADMA属于内源性的NOS抑制剂，其可与NOS结合，从而降低NO的生成[18]。本研究对哮喘急性发作患者与对照组不对称ADMA浓度变化进行比较，哮喘急性发作患者血浆ADMA浓度明显降低。本研究推测不对称ADMA可引发过氧亚硝基阴离子明显变多，进而引发线粒体功能出现障碍，进而产生的过量的活性氧进而导致氧化应激，从而对哮喘发病造成影响。在哮喘的发病机制中，线粒体功能出现障碍发挥关键作用，在哮喘患者的气道中线粒体功能多出现障碍，且其与小鼠变多的过敏性气道炎症具有相关性[19]。哮喘大鼠的气道上皮细胞凋亡上调，气道上皮细胞基质胶原沉积变多，线粒体的数量增多，但线粒体的结构紊乱，多形成板层体和线粒体空泡[19]。本研究发现，哮喘急性发作病人气道粘膜的线粒体SDH和细胞色素C氧化酶的活性变弱；而且线粒体MTP变低，ATP生成明显减少。该结果说明哮喘急性发作病人线粒体功能出现障碍。此外，相关性分析表明不对称ADMA浓度与线粒体SDH、 细胞色素C氧化酶、线粒体MTP以及ATP含量均呈负相关。外源性NOS抑制剂L-NAME能够导致大鼠肝细胞线粒体MTP下降，而NO供体SNAP则能够缓解大鼠肝细胞线粒体MTP的变弱。这说明内源性ADMA的提升与哮喘急性发作病人线粒体功能障碍可能具有直接关系。不对称ADMA能够提升氧化应激的产生。不对称ADMA还能够对NOS产生抑制从而发生氧化应激，不对称ADMA能够使NOS解偶联。其使NO的合成前体L-精氨酸与NOS之间电子传递脱偶联，使O2变成唯一的受电子体，从而导致超氧阴离子产生变多，氧化应激明显变强。此外，其降低NO的合成[20]。本研究发现，哮喘患者气道粘膜NOS活性以及NO含量都出现明显降低，说明ADMA导致细胞中 NOS解偶联，NO合成变少，细胞内还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)消耗变少。

综上所述，哮喘急性发作病人线粒体功能障碍与血浆内源性ADMA浓度升高密切相关。ADMA导致线粒体功能障碍可能与减少NO生成，增加氧化应激，抑制线粒体生物合成有关。