万古霉素在金黄色葡萄球菌中的耐药性研究进展

魏 利，李桂秋

(哈尔滨医科大学附属第一医院检验科，哈尔滨 150001)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一种重要的人类病原体，在19世纪80年代就已经被认为是化脓性脓肿的病因[1]。SA感染的范围从轻微的皮肤和软组织感染到威胁生命的心内膜炎、慢性骨髓炎、肺炎或菌血症，这些感染性疾病的发病率和病死率均较高[2]。在20世纪中期，抗生素如青霉素和甲氧西林的出现和使用，最初被证明对治疗SA感染有效。然而，SA对这些抗生素迅速产生耐药性，且耐青霉素金黄色葡萄球菌感染进一步发展成为难治的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)。近年来，万古霉素虽然被认为是治疗严重MRSA感染的标准方法，但临床上已分离出SA对万古霉素敏感性降低的中介耐药株[3]，主要是广泛报道的异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌[heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus，hVISA，最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)≤2 μg/mL]和万古霉素中介金黄色葡萄球菌(vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus,VISA，MIC 4～8 μg/mL)，或是较少见的对万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus,VRSA，MIC≥16 μg/mL)。现对万古霉素在SA中耐药性的研究进展进行综述。

1 流行病学

1997年，日本平松啓一教授团队首次发现一株对万古霉素的敏感性降低的SA[4]，该团队从1例接受心脏手术后胸骨切口发生化脓性感染患者的分泌物中分离培养出了MRSA，给予该患者万古霉素联合氨苄西林/舒巴坦和阿贝卡星治疗后痊愈。随后，许多国家开始筛选VISA/hVISA。Song等[5]使用琼脂平板筛选法筛选分离了来自12个亚洲国家的1 349株MRSA，58株确认为是hVISA，发生率为4.3%；Lewis等[6]报道在2005—2007年英国血流感染的195例SA标本中检测出hVISA发生率约为18.0%；Sun等[7]收集了来自14个城市的MRSA，在1 012株MRSA中hVISA的发生率为13%～16%。不同国家和地区分离培养出VISA/hVISA菌株数不同，如Mynarczyk等[8]从来自波兰的103株SA菌株中分离VISA/hVISA，分离率为4.8%；Garnier等[9]收集法国2 300株SA菌株，其中VISA/hVISA的分离率为11.1%；Rybak等[10]对美国的356株SA菌株分离VISA/hVISA，分离率为7.6%；Casapao等[11]对美国的66株SA菌株分离VISA/hVISA，分离率为18.8%。各国家或地区的分离率不同，这些差异的主要原因可能是不同患者、不同地域和不同的检测方法造成的。

2 VRSA和VISA的分子机制

2.1VRSA的分子机制 VRSA(MIC≥16 μg/mL)由转座子Tn1546编码的VanA操纵子编码，通过保留原始的肠球菌质粒或通过将万古霉素耐药肠球菌质粒中的Tn1546转换成葡萄球菌常驻质粒而发挥耐药作用[12]。

细菌细胞壁的主要成分是交联的肽聚糖，肽聚糖主要由通过甘氨酸桥和五肽(UDP-MurNAc-L-Ala-D-iso-Gln-L-Lys-D-Ala-D-Ala)彼此交联的聚糖链N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸组成。在革兰阳性菌中，万古霉素通过与新合成的UDP-MurNAc-五肽的倒数第2个D-Ala-D-Ala残基形成非共价氢键，抑制后期肽聚糖的合成，从而破坏下游肽聚糖组装。所以，当给予万古霉素治疗SA感染后，万古霉素-五肽复合物可在细胞内形成,进而抑制细胞壁的合成，杀死细菌[13]。

VanA操纵子介导的万古霉素耐药主要通过两个重要步骤：①水解与万古霉素结合的二肽D-Ala-D-Ala肽聚糖前体；②不能结合万古霉素的D-Ala-D-Lac肽聚糖前体的合成[14]。VanA操纵子由VanA、VanH、VanX、VanS、VanR、VanY和VanZ基因组成。VanA操纵子是通过由VanS和VanR编码的双重传感器-调节子系统控制的，分别识别万古霉素并激活操纵子的转录[15]。VanA、VanH和VanX是万古霉素抗性表型必不可少的部分，其中，VanA和VanH负责合成缩肽D-Ala-D-Lac；VanA是催化D-Ala-D-Lac缩酚酸酯酯键形成的连接酶；VanH是通过还原丙酮酸盐形成D-Lac的脱氢酶[16]；VanX是D，D-二肽酶，水解D-Ala-D-Ala酯键，确保减少新形成的D-Ala-D-Lac缩酚酸肽与结合UDP三联肽聚糖前体的竞争。VanY是一种D,D-羧基肽酶，通过促进已经附着在茎五肽结构末端的D-Ala-D-Ala二肽的裂解来执行类似的功能，但不是必需功能[17]。VanZ的作用尚不清楚，但它可能与SA对替考拉宁的耐药性有关。

2.2VISA的分子机制 VISA通常与持续感染、万古霉素治疗时间延长等有关。hVISA表型是指亲代SA对万古霉素敏感(MIC≤2 μg/mL)，而子代SA可以含有少量能在万古霉素≥4 μg/mL培养基中生长的耐药亚群[18]。尽管近年来对hVISA的研究取得了一定的进展，但hVISA发展的分子机制尚未完全确定。如Roch等[19]证明，SA暴露于非糖肽类抗生素如β内酰胺类可能会引发hVISA表型。Haaber等[20]报道USA300菌株暴露于黏菌素，增强了万古霉素的耐药性，证明这种现象是在基因表达水平上进行调节，因此是可逆的。上述研究为hVISA的发展是表观遗传学过程提供了证据。

目前普遍认为VISA对万古霉素具有均一的耐药性，VISA是由长期使用糖肽类抗生素治疗的hVISA发展而来[19-20]。VISA表型的基本特征包括由差异调节的细胞壁生物合成和刺激途径引起的细胞壁厚度增加，肽聚糖的交联减少，与细胞壁更新相关酶的自溶活性降低，表面蛋白质谱改变，辅助基因调节因子(agr)系统的功能障碍和生长特性变化[21]。近年来，已形成多种研究VISA表型的分子遗传基础的方法。Katayama等[22]通过向万古霉素敏感金黄色葡萄球菌(vancomycin susceptible S. aureus，VSSA)毒株N315的6个不同基因中引入序列突变来产生实验室衍生的VISA毒株，研究发现VSSA菌株最有可能逐步发展成万古霉素中介菌株，通过获得突变且每个突变都可以降低万古霉素的易感性。

VISA耐药的分子机制尚不明确，但是编码双重调节系统的基因突变(如与糖肽抗性相关的graRS和walKR对VISA的耐药性)至关重要。DNA依赖性的RNA聚合酶β亚基的基因编码能够通过增加细胞壁的厚度增加对万古霉素的耐药性[23]。graRS差异调节细胞壁生物合成基因的转录，与在VISA表型中起作用的基因和调节子有关[24]。graRS上调生物膜合成操纵子中的基因，导致生物膜生产增加。两项独立研究发现，graRS中的点突变降低了对万古霉素的易感性，此外，graRS上调dlt操纵子和mprF/fmtC基因，与磷壁酸丙氨酰化和细胞壁电荷的改变有关[23-24]。graRS突变与全球调节因子阻遏毒素(rot)和agr的修饰表达有关[19,23]。在hVISA和VISA菌株中，agr功能降低，有利于万古霉素耐药性的发展，并有可能促进生物膜的生成，最终增加hVISA的存活率[25]。VISA分离株在vraSR基因中具有非沉默突变,这种突变可能导致下游超过40个细胞壁合成基因的上调，包括产生细胞壁衍生物如D-Ala-D-Ala)所需的基因[26]。walKR是与VISA表型相关的另一种双组分基因调控系统，通过获得的突变或插入IS256下调walKR操纵子导致多糖合成增加，细胞壁厚度增加，自溶减少[18,24]。另外，与VSSA菌株相比，VISA菌株可能通过使醋酸盐的分解代谢下降，从而导致细菌的生长特性发生改变、细胞死亡改变，抗生素耐受性以及细胞间黏附的多糖合成增加[27]。产生万古霉素中介表型的上述遗传修饰可以在不同分离株之间有显著差异，某些突变通常与特定的SA谱系有关。尽管如此，Vidaillac等[28]证明亲本遗传背景不一定能导致VISA表型的突变，而来源于相同亲本分离株的平行分离株可以在各种环境压力下获得不同突变。Berscheid等[29]证明，VSSA菌株在体外的序列突变可产生万古霉素MIC≥32 μg/mL的分离株，超过了VRSA的折点。这种机制与VanA型万古霉素抗性相反，万古霉素不能与修饰的D-Ala-D-Lac肽结合。hVISA/VISA分离株细胞壁更厚，肽聚糖交联的减少和游离D-Ala-D-Ala残基过量是在细胞壁内作为万古霉素的靶标；另外，结合D-Ala-D-Ala的万古霉素在细胞壁积累，从而阻碍万古霉素的进一步扩散[17,29]。然而，有研究表明[30]，万古霉素耐药水平较高的VISA菌株较不稳定，往往恢复到与hVISA或万古霉素耐药性的较低水平。

3 临床分类和治疗

临床上感染hVISA/VISA患者越来越普遍，感染后会引起万古霉素治疗的失败。影响VISA和hVISA的临床因素较多，其中一个重要因素是缺乏前瞻性对照研究。临床上普遍认为SA中低水平的万古霉素耐药与万古霉素治疗失败和不良的临床结果有关。为提高hVISA/VISA检出率，2006年，临床实验室标准化协会将SA对万古霉素耐药临界值进行了更新，规定VISA的MIC为4～8 μg/mL，MIC≤2 μg/mL为VSSA，MIC≥16 μg/mL为VRSA[31]。临床研究普遍认为，对于MIC>8 μg/mL的VISA感染，糖肽类抗生素的治疗并不是最佳的[32]。另外，对于深部脓肿、骨髓炎和心内膜炎等有大量hVISA感染，可考虑手术治疗[32]。

达托霉素是hVISA和VISA感染的替代治疗选择，有研究指出，在体外菌株的万古霉素高MIC值与达托霉素的非敏感性之间具有相关性[33]。由于达托霉素的杀菌活性取决于使用浓度，故需要较高剂量达托霉素MIC治疗心内膜炎和以抗微生物穿透力差为特征的感染部位的hVISA和VISA感染[34]。体外研究观察到在模拟心内膜赘生物中用高剂量达托霉素[10 mg/(kg·d)持续8 d]和剂量递减[10 mg/(kg·d)，持续4 d，接着6 mg/(kg·d)，持续4 d方案与标准方案6 mg/(kg·d)，持续8 d]和剂量递增[6 mg/(kg·d)，持续4 d，然后10 mg/(kg·d)，持续4 d]，两种方案相比,剂量递减方案对hVISA毒株的杀伤作用显著增加(P<0.024)[34]。以上达托霉素给药方法可能导致体内菌血症更快治愈，并防止达托霉素不敏感的情况出现[34]。然而，尚未发表评估高剂量达托霉素给药剂量和适当持续时间的体内研究。高剂量达托霉素单独用于hVISA或VISA感染患者的作用尚不清楚。在有更多证据可供使用前，对于可能存在hVISA或VISA感染风险的患者(如高细菌负荷感染，万古霉素治疗失败)考虑使用达托霉素时需要谨慎。

Mdicines公司开发的新型糖肽类抗菌药物奥利万星，对包括耐万古霉素的葡萄球菌、肠球菌等革兰阳性菌具有良好抗菌活性，通过多重作用机制防止耐药性产生，进而减少耐药形成[38]。

4 小 结