柚叶总黄酮对LPS所致Caco2结肠上皮细胞间高通透性的保护作用

宋家乐,钱 波,王程强,曾 榛,吴 华,高 扬,*

(1.桂林医学院公共卫生学院,广西桂林 541100;2.东南大学公共卫生学院,江苏南京 210009;3.广西高校预防医学重点实验室,广西桂林 541100;4.扬州大学附属苏北人民医院药学部,江苏扬州 225001)

柚子(CitrusmaximaMerr.)属芸香科柑橘属乔木,是广西、广东和福建等我国广大南方地区栽培面积和产量较高的经济水果之一[1]。桂林地区的阳朔、平乐和荔浦等地均为广西重要的柚子产地,年产量较大。近年来,植物类多酚和黄酮类物质因其具有的抗菌、抗炎、抗氧化、抗衰老和免疫调节等多种生物活性而受到科学研究的重视,并成为资源开发利用的重点[2]。在传统柚子的采摘及深加工过程中,富含多酚与黄酮类物质的柚叶作为农业资源废弃物而被丢弃,这造成了生物资源的极大浪费[3-4]。

研究发现,溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)和克罗恩病(Crohn’s disease)等炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD),肠应激综合征(irritable bowel syndrome,IBS)及肠道肿瘤的发生与患者肠道上皮组织的健康状况存在很大关联。肠黏膜屏障功能障碍是诱发IBD、IBS及肠道肿瘤的重要原因[5]。肠黏膜屏障是分别由肠黏膜上皮构成的机械屏障,来自肠黏膜组织所分泌的黏液和消化液所组成的化学屏障,由肠道中固有微生物菌落所构成的生物屏障,由肠道组织中免疫系统及其所分泌的免疫物质构成的免疫屏障等四部分所构成的具有维持肠内环境稳定功能,阻隔外源性有害物质进入血液循环系统的一类具有特殊生理功能的结构[6]。因此,肠上皮细胞和细胞间紧密连接(tight junction,TJs)在防止病原微生物入侵,细菌移位等方面具有重大意义[7]。临床IBD患者及肠道肿瘤患者的肠上皮组织中的细胞间紧密连接结构遭受破坏,上皮细胞通透性增大,肠黏膜屏障损毁严重[8]。改善肠上皮功能,维持细胞间紧密结构完整则有助于改善IBD、IBS及肠道肿瘤患者的临床症状[9]。

当前,鲜见关于柚叶总黄酮提取物对于肠道上皮细胞高通透性保护作用的研究报道。而人结肠癌Caco-2细胞是被公认用于研究肠道屏障损伤与修复机制研究的经典细胞系,该细胞系具有与正常小肠上皮细胞类似的紧密连接、微绒毛等结构及酶系分泌功能[10]。因此,本实验设想通过利用细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导Caco-2细胞建立细胞高通透性模型。并以此模型来研究柚叶总黄酮是否能够对细胞高通透性起到改善作用,同时就此探讨可能的保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜柚叶 采自广西壮族自治区平乐县龙窝果园,并经桂林医学院药学院生药学教研室鉴定;Caco-2人结肠腺癌细胞系 由桂林医学院生物技术学院邹先琼教授馈赠,本实验室保藏,细胞引种自中国科学院上海细胞资源中心;DMEM高糖型细胞培养液、青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶-EDTA消化液、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、Trizol试剂、OligodT18、RNase、dNTP、MLV逆转录酶 美国Thermo Scientific公司;Transwell 小室(货号354482) 美国Corning公司;ROX reference Dye、SYBR Premix Ex Taq II 日本TAKARA公司;异硫氰酸荧光素(FITC)-右旋糖酐(FD40,分子量40000 Da)、大肠杆菌脂多糖(LPS)、Hank’s平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution,HBSS) 美国Sigma-Aldrich公司;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒 南京建成生物工程研究所;IL-1β、IL-8、TNF-α试剂盒 美国Cloud colon公司;芦丁(rutin)标准品 中国药品生物制品检定所；无水氯化铝、醋酸钠和醋酸 上海梯希爱化成工业发展有限公司；其他化学试剂 均为国产分析纯。

EYELA N-1001S真空旋转蒸发仪 东京理化器械株式会社;Biotek Elx808酶标仪 美国伯腾仪器有限公司;ND2000超微量核酸蛋白测定仪、3110型二氧化碳细胞培养箱 美国Thermo Scientific公司;AL204电子分析天平 梅特勒-托利多公司上海有限公司;电热恒温水浴锅HWS-28 上海一恒科学仪器有限公司;FLUOstar OPTIMA荧光酶标仪 德国BMG公司;MERS00002 Millicell-ERS上皮跨膜细胞电阻仪 美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柚叶总黄酮提取物的制备 双蒸水冲洗新鲜柚叶除杂后,真空冷冻干燥。冻干柚叶经粉碎后过60目筛备用。取柚叶粉(10 g)加入300 mL乙醇(80%,V/V)后,在80 ℃条件下提取6 h[2]。滤液经3000×g离心15 min后弃渣收集上清液,50 ℃真空减压旋转蒸发后,制成柚叶总黄酮提取物。

1.2.2 提取物中总黄酮含量测定 采用氯化铝比色法测定提取物中总黄酮含量。在10 mL的标准比色管中分别加入0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL的芦丁溶液(0.4 mg/mL),随后加入2.0 mL的氯化铝溶液(0.1 mol/L)和3.0 mL的醋酸钠-醋酸溶液(pH5.4),避光反应30 min后,分别测定420 nm处吸光度,算得标准曲线(Y=6.342X-0.035,R2=0.995)。计算出提取物中黄酮含量为11.54 mg rutin/g,总黄酮提取物置于-80 ℃储存待用。

1.2.3 细胞的培养与实验分组 Caco-2人结肠腺癌细胞用DMEM培养液(含10%的FBS与1%青-链霉素双抗液)置于37 ℃、5% CO2环境下湿化培养。细胞贴壁长至80%时,胰蛋白酶-EDTA液按比例消化传代,取指数期细胞用于实验。以DMEM培养液(含LPS:2 μg/mL)处理细胞24 h制备细胞模型。模型细胞以柚叶总黄酮提取物(0、10、50、100、150 μg/mL)继续培养24 h并进行后续实验。正常组为未经过任何处理的正常Caco-2细胞。

1.2.4 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)水平及细胞存活率的测定 所有细胞按1.2.3中所述分组进行处理后,首先收集96培养板中培养基上清液,采用比色试剂盒按照说明书操作要求进行LDH酶活性测定。细胞生存率测定时,在已移除培养基的96培养板中加入100 μL含MTT试剂(终质量浓度:0.5 mg/mL)的细胞培养基继续培养4 h。待培养结束后弃上清液,每孔加入100 μL的DMSO试剂避光振荡30 min,测定OD490 nm后按公式:细胞生存率(%)=OD样品组/OD正常组×100来计算细胞生存率。

1.2.5 细胞因子白介素(interlukin-1β,IL-1β),IL-8和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)分泌水平测定 细胞接种至培养板,并依照前述1.2.3中所述浓度进行样品处理。待实验终点时,4 ℃下收集培养上清液,按照ELISA测定试剂盒说明步骤操作测定IL-1β、IL-8和TNF-α水平(单位以pg/mL表示)。

1.2.6 细胞膜通透性水平测定 实验前测定跨上皮细胞电阻(trans epithelial electrical resistance,TEER),选取屏障完整的细胞(TEER≥100 Ω.cm2)用于实验。细胞接种至Transwell小室中并依1.2.3所述处理。移除Transwell小室内外的培养液,HBSS液(pH7.4)冲洗细胞3次,37 ℃孵育30 min后测量TEER值,待TEER值稳定后记录数据。此外,在Transwell小室顶端腔内加入100 μL的HBSS液(含有终浓度为1 mg/mL的FD-40),37 ℃孵育2 h,收集侧腔内溶液,使用FLUOstar OPTIMA荧光酶标仪测定荧光强度(激发波长480 nm,发射波长530 nm)。

1.2.7 qRT-PCR法检测细胞中相关因子的mRNA转录水平 qRT-PCR法检测细胞中相关因子的mRNA转录水平。使用Trizol试剂提取细胞总RNA,ND2000超微量核酸测定仪检测提纯后的RNA浓度用于后续实验。取总RNA(2 μg)加入dNTPs(1 μL)、OligodT18引物(1 μL)、MMLV逆转录酶(1 μL)、RNases抑制剂(1 μL)及5×Buffer(10 μL)逆转录成cDNA。取适量cDNA(2 μL)用qRT-PCR法检测闭锁蛋白(Occludin)、紧密连接蛋白-1(claudin-1)、封闭小带蛋白(ZO-1)和肌球蛋白轻链激酶(MLCK)的表达量。在总反应体系中(20 μL)加入对应引物(10 μmol/L)各1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq II(10 μL)、50×ROX reference Dye(0.4 μL)和灭菌双蒸水(5.6 μL),充分混匀后置于Quant Studio TM 6 Flex PCR仪中进行反应。扩增反应条件为95 ℃ 30 s,95 ℃ 25 s,55 ℃ 25 s,72 ℃ 50 s,共40个循环,72 ℃延伸5 min。每个基因cDNA样本平行扩增3次,取Ct值均数,依公式计算目的基因表达量[F=2(检测样品中基因的Cr值-检测样品中持家基因的Cr值)/2(空白样品中基因的Cr值-空白样品中持家基因的Cr值)]。相关基因的引物序列如下所述:IL-1β(上游:5′-GAATGACGCCCTCAATCAAAGT-3′,下游:5′-TCATCTTGGGCAGTCACATACA-3′),IL-8(上游:5′-CCTGAACCTTCCAAAGATGGC-3′,下游:5′-TTCACCAGGCAAGTCTCCTCA-3′),TNF-α(上游:5′-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3′,下游:5′-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3′),Occludin(上游:5′-CTTCCAATGGCAAAGTGAATGAATGA-3′,下游:5′-TACCACCGCTGCTGTAACGAG-3′),claudin-1(上游:5′-CCAGGTACGAATTTGGTCAGG-3′,下游:5′-TGGTGTTGGGTAAGAGGTTGT-3′),ZO-1(上游:5′-GAGCCTAATCTGACCTATGAACC-3′,下游:5′-TGAGGACTCGTATCTGTATGTGG-3′),MLCK(上游:5′-CAACAGGGTCACCAACCAGC-3′,下游:5′-GCCTTGCAGGTGTACTTGGC-3′),GAPDH(上游:5′-CCATTTGATGTTAGCGGGATCTC-3′,下游:5′-TGGTCTACATGTTCCAGTATGACT-3′)。

1.3 数据处理与统计分析

本研究中,所有实验均重复3次,结果以均值(means)±标准偏差(SD)表示。实验数据运用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析与统计处理,p<0.05为具有统计差异。

2 结果与分析

2.1 柚叶总黄酮提取物对LPS所致Caco-2细胞生存率和细胞LDH释放水平的影响

人结肠癌Caco-2细胞经LPS(2 μg/mL)处理后,细胞的生存率较正常组细胞相比下降至43.86%(图1)。受损细胞的生存率随柚叶总黄酮提取物处理浓度的增加呈逐渐升高之趋势,并呈现出显著的剂量效应关系(p<0.05)。高浓度(100和150 μg/mL)的柚叶总黄酮提取物处理后,受损细胞的生存率分别升高至71.3%和86.1%。

细胞遭受外界强烈的应激刺激导致细胞膜损伤后,在正常生理情况下稳定存在于细胞内部的功能酶LDH能够直接从细胞内部溢出。因此,LDH是常用于评估细胞损伤发生程度的生物指标之一[10]。与正常细胞相比,LPS处理导致细胞中LDH的溢出量较正常组细胞增加4.29倍(图1)。而柚叶总黄酮提取物处理能够显著降低受损细胞中LDH的外溢水平,且抑制效果存在显著的剂量效应关系(p<0.05)。高浓度柚叶总黄酮提取物(100和150 μg/mL)处理受损细胞后,细胞中LDH溢出水平较未经柚叶总黄酮处理过的模型细胞中LDH的溢出水平分别降低38.7%和57.9%。

图1 柚叶总黄酮提取物对LPS处理后的Caco-2细胞生存率和细胞内LDH释放水平的影响Fig.1 Effects of PLTFE on cell viability and LDH levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells 注:不同字母不同表示组间差异显著(p<0.05);图2～图5同。

2.2 柚叶总黄酮提取物对LPS处理Caco-2细胞中IL-1β、IL-8、TNF-α分泌水平的影响

异常升高的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎细胞因子是导致肠组织细胞间紧密连接丢失、细胞上皮屏障损伤及IBD、IBS等消化道疾病的主要原因之一[11-14]。LPS(2 μg/mL)刺激能够显著增加Caco-2细胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的分泌(p<0.05)(图2)。经不同浓度柚叶总黄酮提取物干预后,细胞内IL-1β、IL-8和TNF-α异常升高的分泌水平均得到显著抑制(p<0.05)。100和150 μg/mL的高浓度柚叶总黄酮提取物,能使损伤细胞中IL-1β的分泌水平较LPS模型细胞中IL-1β水平分别降低36.53%和45.03%,IL-8的分泌水平分别降低39.66%和51.13%。而在TNF-α分泌水平方面,柚叶总黄酮提取物(100和150 μg/mL)能够使TNF-α水平较LPS模型细胞中TNF-α水平分别降低46.47%和53.80%。

图2 柚叶总黄酮提取物对LPS处理Caco-2细胞中IL-1β、IL-8和TNF-α分泌水平的影响Fig.2 Effects of PLTFE on IL-1β,IL-8 and TNF-α levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

2.3 柚叶总黄酮提取物对LPS处理Caco-2细胞中IL-1β、IL-8与TNF-α的mRNA转录水平的影响

LPS(2 μg/mL)处理能够显著刺激Caco-2细胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA转录(图3)。不同浓度的柚叶总黄酮提取物处理细胞后,细胞内IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA转录水平均得到显著抑制(p<0.05)。较未经过柚叶总黄酮提取物处理的LPS模型组细胞而言,高浓度柚叶总黄酮提取物(100和150 μg/mL)能够分别有效降低LPS模型细胞中IL-1β的转录水平至28.45%和41.77%,IL-8转录水平至22.43%和26.73%。同时,柚叶总黄酮提取物还能显著抑制LPS模型细胞中TNF-α的转录水平至30.12%和35.85%。而抑制IL-1β、IL-8和TNF-α等的过度表达,能够降低肠道组织中的炎性水平,减缓高炎症环境下导致肠上皮细胞间细胞紧密连接丢失的发生[12-14]。

图3 柚叶总黄酮提取物对LPS处理Caco-2细胞中IL-1β、IL-8和TNF-α的mRNA转录水平影响Fig.3 Effects of PLTFE on IL-1β,IL-8 and TNF-α mRNA expression in LPS treated intestinal Caco-2 cells

2.4 柚叶总黄酮提取物对LPS处理Caco-2细胞的膜通透性影响

反映肠上皮屏障模型离子通透性改变情况的跨上皮细胞电阻(TEER)值,是用于检测肠上皮细胞单层屏障功能变化的经典指标之一[15]。LPS处理显著造成Caco-2细胞TEER值的降低(图4)。给予不同浓度柚叶总黄酮能够显著提升模型细胞的TEER值(p<0.05)。柚叶总黄酮提取物(10、50、100和150 μg/mL)处理后,细胞的TEER值分别较未经处理的LPS组TEER值升高1.07倍、1.20倍、1.63倍和1.95倍。此外,反映肠屏障细胞模型大分子物质透过能力的异硫氰酸荧光素(FITC)-右旋糖酐(FD-40)透过率,同样也是反映细胞间紧密连接和细胞单层屏障功能的常用指标之一[16]。FD-40的数值与肠上皮屏障模型细胞的通透性成正相关[17]。如图4所示,LPS处理显著造成Caco-2细胞的通透性增高,模型细胞的FD-40透过水平在经柚叶总黄酮处理后均呈显著下降趋势(p<0.05)。其中,柚叶总黄酮提取物(10、50、100和150 μg/mL)处理组中细胞的FD-40水平分别较LPS组细胞的FD-40透过水平降低6.14%、18.13%、28.15%和39.04%。

图4 柚叶总黄酮提取物对LPS处理Caco-2细胞TEER与FD-40透过水平的影响Fig.4 Effects of PLTFE on TEER and FD-40 flux levels in LPS treated intestinal Caco-2 cells

2.5 柚叶总黄酮提取物对LPS处理Caco-2细胞中Occludin、claudin-1、ZO-1和MLCK的mRNA转录水平影响

相邻肠上皮细胞间紧密连接所形成的环带状蛋白复合体,是构成肠上皮屏障的基本单位,肠上皮屏障的重要生理功能在于参与调控物质的跨上皮运输,维持细胞间的构造的稳定及负责细胞间的相互通讯等[18]。Occludin、claudin-1与ZO-1都是构成TJ结构的重要组成部分[19]。LPS处理造成Caco-2细胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA转录水平呈显著下降趋势(图5)。LPS组细胞与正常组细胞相比较发现,Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA转录水平分别下降67.30%,42.63%和55.86%。而给予柚叶总黄酮提取物处理后,受损细胞中Occludin、claudin-1和ZO-1的mRNA转录水平均显著回升。特别是100和150 μg/mL的高浓度柚叶总黄酮提取物处理后,Occludin转录水平较LPS模型细胞分别提升了1.62倍和1.97倍;claudin-1转录水平较LPS模型细胞分别提升了1.37倍和1.49倍;ZO-1转录水平较LPS模型细胞分别提升了1.81倍和2.04倍。属于钙调素激酶的MLCK在参与调控细胞间TJ结构的过程中也起着非常重要的作用。当外界刺激导致MLCK自身被激活后,MLCK能够迅速通过磷酸化肌球蛋白轻链(MLC),动员其参与肌动蛋白收缩,使细胞骨架发生重排[20]。而细胞骨架的重排又能直接引发细胞TJ结构的异常,造成细胞间隙的直接开放,最终导致细胞间通透性增高[21]。如图5示,相比正常细胞组中MLCK的mRNA转录水平而言,LPS处理后的Caco-2细胞中MLCK的转录水平显著升高(p<0.05)。相反,模型细胞中经过柚叶总黄酮提取物处理后,MLCK的mRNA转录水平均得到抑制。高浓度柚叶总黄酮提取物(100与150 μg/mL)能够显著抑制MLCK的mRNA转录水平(抑制率为13.31%和23.82%)。适当调控肠上皮细胞中MLCK的活化程度,对于维持肠上皮细胞屏障以及维持细胞间紧密连接的正常具有非常重要的作用[22]。

图5 柚叶总黄酮提取物对LPS处理Caco-2细胞中细胞间紧密连接相关因子的mRNA转录水平的影响Fig.5 Effects of PLTFE on tight junction related factors mRNA expression in LPS treated intestinal Caco-2 cells

3 结论

本研究利用LPS构建Caco-2肠上皮细胞高通透性细胞模型,主要研究了柚叶总黄酮提取物对模型细胞发生高通透性的改善效果。研究结果提示,柚叶总黄酮提取物首先能有效抑制LPS处理所造成的细胞损伤,提升受损细胞的生存率,并抑制损伤细胞内LDH的外溢。同时,柚叶总黄酮提取物能有效抑制LPS所导致模型细胞中IL-1β、IL-8和TNF-α等炎性细胞因子分泌,并抑制这些炎性细胞因子的mRNA转录。柚叶总黄酮提取物的处理还能改善模型细胞膜高通透性的发生,而在细胞通透性关联TJ相关因子调控方面,柚叶总黄酮提取物能够显著上调受损细胞中紧密连接相关因子(Occludin、claudin-1和ZO-1)的mRNA转录,并显著降低MLCK的mRNA高转录。综合上述实验结果,柚叶总黄酮提取物对LPS所致Caco-2细胞发生高通透性的保护作用可能与其具有较强的抗炎作用效果,及其对细胞紧密连接相关因子的mRNA转录水平的调控能力存在一定的关系。而在今后的研究中,课题组将以负责调控细胞紧密连接蛋白表达的MLCK信号通路作为研究重点,并对该通路活化过程中各上、下游信号分子的调控作用展开深入研究。