高温液态水预处理结合表面活性剂促进纤维素酶水解玉米芯

戴 莉，刘 凯，韩 峰，艾仕云，周 双

（1.山东农业大学化学与材料科学学院，山东泰安 271018；2.山东农业大学生命科学学院，山东泰安 271018）

利用现代生物和化学技术，开发和利用可再生的木质纤维素，将其转化为燃料和化学品，可以降低对不可再生的石油资源的依赖，实现人类社会可持续发展[1-3]。然而，在与自然界长期抗争的过程中，植物形成了复杂、致密的细胞壁结构，纤维素、半纤维素和木质素以不同的方式共存于细胞壁中，相互紧密交织在一起[4，5]，导致直接降解木质纤维素难度较大，周期长，很难进行高效的工业化应用，因此对生物质进行有效的预处理并在微生物催化转化过程中加入助剂，以提高其转化效率十分必要[6-10]。

作为一种环境友好的预处理方式，高温液态水预处理工艺不需要添加任何其他化学试剂，只利用热量和水的自催化作用，就可以使生物质中的半纤维素发生降解，从而打破纤维素的天然屏障，增大纤维素可及度，提高纤维素的可降解性和反应活性[11-13]。但是高温液态水处理过程中，木质素的去除率有限[14，15]，大量残留的木质素除了形成物理屏障阻碍纤维素和纤维素酶接触外，还会对纤维素酶进行非反应性吸附，减少降解纤维素的纤维素酶有效数量[16-20]。据报道，非离子表面活性剂能够维持酶的活力[21]，并可以通过与木质素结合，屏蔽木质素对纤维素酶的非反应性吸附，从而提高木质纤维素的转化效率[22-24]。因此，本文将天然玉米芯进行高温液态水预处理后，采用纤维素酶将其催化降解，酶解过程中添加适量的非离子表面活性剂Tween 80，并研究其对酶催化过程的促进方式及效果。

1 实验部分

1.1 主要材料与化学试剂

玉米芯采自山东省泰安市，自然晾干后粉碎，过筛，封口袋中保存备用。纤维素酶由白银赛诺生物科技有限公司提供，其内切葡聚糖酶活力为527 IU/g，滤纸酶活力为120 FPU/g，β-葡聚糖苷酶活力为105 IU/g。Tween 80、柠檬酸钠、柠檬酸、3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、苯酚、无水硫酸钠、羧甲基纤维素、葡萄糖、硫氰酸铵、硝酸钴等均为分析纯，购自上海麦克林生化科技有限公司，使用前未经其他处理。

1.2 高温液态水预处理

按照1：15的固液比将玉米芯和去离子水加入反应釜，180℃下反应1 h。为防止固体深度降解，到达反应时间后立即用自来水将反应釜冷却至室温。反应后的固体部分用去离子水清洗备用。

1.3 玉米芯成分分析和结构表征

玉米芯的表面形貌采用PHENOM PRO型台式扫描电子显微镜观察，工作电压5 kV～15 kV，放大倍数为 500 k～10 k。

玉米芯晶相分析在荷兰帕纳科有限公司的X’Pert 3 Powder型X射线粉末衍射仪上进行，Cu靶，Kα辐射源，管电压40 kV，管电流40 mA，扫描范围5.0°～40.0°，扫描速度 0.12 °/s。

高温液态水预处理前后玉米芯的成分参考美国可再生能源实验室（NREL）的方法进行分析[25，26]。

1.4 纤维素酶催化水解

称取1 g绝干底物置于250 mL锥形瓶中，按固液比1：50加入0.05 mol/L pH 4.8的柠檬酸缓冲液，以20 FPU/g（绝干底物）的量加入纤维素酶，加入适量Tween 80后，振荡均匀并置于50℃、150 r/min的恒温振荡器中反应，定期取样，分别用3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）和考马斯亮蓝G 250法（Bradford法）检测水解液中的还原糖（RS）和蛋白质的含量。纤维素酶吸附率计算式如下：

1.5 Tween 80与玉米芯的吸附

取50 mL 0.05 mol/L pH 4.8的柠檬酸缓冲液，加入1 g玉米芯，0.1 mL Tween 80，置于恒温振荡器中，50℃，150 r/min下震荡90 min，每隔15 min取样，上清液采用硫氰酸钴铵溶液显色法检测Tween 80的含量，以不加玉米芯的实验作为对照组，按照下面的公式计算Tween 80的吸附率：

1.6 Tween 80与纤维素酶的相互作用

分别配制纤维素酶溶液和纤维素酶-Tween 80溶液，用紫外分光光度计在2 000 nm～500 nm范围内进行扫描，得到两种溶液的紫外光谱图。

2 结果与讨论

2.1 高温液态水预处理对玉米芯成分和结构的影响

处理前后玉米芯的表面状况（见图1），未处理的玉米芯表面比较平滑，质地紧密，无明显的纤维素束状结构。经过高温液态水预处理后，玉米芯表面结构发生明显的变化，大量纤维暴露出来，从而增大了比表面积，提高了纤维素的可及度，这对纤维素酶水解纤维素起到积极作用。

处理前后玉米芯结晶度和成分的变化（见表1）。比较发现，处理后玉米芯的结晶度显著上升，这与基于混合物计算结晶度的方法和处理后成分的变化情况有关。相比天然玉米芯，高温液态水处理后的玉米芯中，纤维素得到了明显富集，半纤维素含量显著减少，仅有5.89%，而纤维素的富集导致结晶纤维素在物料中的比例增大，因此结晶度有所增加。

因此，研究结果表明，高温液态水处理可以有效降解生物质中大部分半纤维素，为纤维素酶进攻并降解纤维素清扫障碍，然而处理后结晶度上升，且大量木质素保留，这些都会对后期纤维素酶催化降解产生不利影响。

2.2 Tween 80、纤维素酶及酶解底物的相互作用

酶解过程中，木质素除了对纤维素起到物理屏蔽作用外，还会对纤维素酶进行非反应性吸附，而吐温系列表面活性剂的加入会竞争木质素上的吸附位点，能够在一定程度上减少木质素对纤维素酶的非反应性吸附[27]。天然玉米芯对Tween 80及纤维素酶的吸附曲线（见图2）。由图2A可见，Tween 80在玉米芯上有相当量的吸附，且约15 min后即可达到吸附平衡；而图2B显示，玉米芯对纤维素酶的吸附率呈现周期变化，这是因为纤维素酶对纤维素的降解是一个不断吸附、反应、脱附和再吸附的过程，与前期实验结果吻合[28]。通过比较发现，约15 min时对照组中玉米芯对纤维素酶吸附率达到最高值，后期纤维素酶吸附规律性较差，周期较长，添加了Tween 80后，初期纤维素酶吸附率略低于对照组，而后期纤维素酶的吸附-解吸附规律性增强，吸附周期缩短，这是由于Tween 80能很快占据木质素上的吸附位点的缘故。结果说明Tween 80的加入能够有效改善纤维素酶的吸附-解吸附特性。

图1 预处理前后玉米芯的扫描电镜图Fig.1 SEM micrographs of raw（A）and pretreated（B）corncobs

表1 高温液态水预处理前后玉米芯结晶度和成分变化Tab.1 Changes of corncob crystallinity and composition before and after HLW pretreatment

图2 天然玉米芯对Tween 80和纤维素酶的吸附Fig.2 Absorption of Tween 80（A）and cellulase（B）by the raw corncob

由纤维素酶以及纤维素酶与Tween 80共存的紫外吸收光谱图（见图3）可以看出，由于Tween 80的存在，纤维素酶肽键引发的吸收峰由243 nm红移到253 nm，可能的原因是Tween 80对纤维素酶肽键的共价结构产生了影响[29]，同时酪氨酸和色氨酸的出峰位置（280 nm左右）也出现了轻微的变化。由于吸附域的结构变化会影响纤维素酶与底物结合[30]，因此，虽然Tween 80的添加会改善纤维素酶的吸附-解吸附性能以利于水解纤维素，但是加入过量也可能严重影响蛋白质结构，从而抑制纤维素酶的活力，因此需要合理优化Tween 80的添加量。

图3 纤维素酶与Tween 80的紫外吸收光谱Fig.3 UV absorption spectrum of cellulase and Tween 80

2.3 表面活性剂添加量对酶解过程的影响

利用未处理的玉米芯进行酶催化水解，并考察Tween 80添加量对水解效果的影响，结果（见图4），水解72 h后的结果显示，Tween 80的添加可对酶解过程有改善作用。随着Tween 80添加量的增大，玉米芯经纤维素酶水解72 h后，水解液中还原糖的浓度逐渐增大；当Tween 80的添加量达到0.1 mL/g绝干底物时，还原糖浓度达到7.41 mg/mL，与未添加Tween 80的对照实验相比，提高了56.99%；进一步增加Tween 80的量时，还原糖浓度开始下降。由此可见，非离子表面活性剂在改善酶解效率方面存在最佳浓度，这与前面2.2的结论一致。基于本实验结果，Tween 80的最佳添加量为0.1 mL/g绝干底物。

图4 Tween 80添加量对酶解过程a的影响Fig.4 Effect of Tween 80 dosage on enzymatic hydrolysis processa

2.4 高温液态水预处理和Tween 80辅助水解的酶解效果

图5 高温液态水处理结合Tween 80对酶解过程的影响Fig.5 Effect of HLW pretreatment combined with Tween 80 on enzymatic hydrolysis processa

未经预处理、无表面活性剂添加的对照组（见图5），玉米芯酶解产还原糖的量最低，96 h水解液中还原糖的浓度仅为4.50 mg/mL，且由于产物抑制作用，48 h后再延长酶解时间对产糖意义不大；而添加了Tween 80后，不仅酶解全程还原糖浓度有所增加，而且产物的抑制作用也在一定程度上有所减弱，96 h水解液中还原糖浓度比48 h的提高了13.55%；高温液态水处理后的玉米芯在酶解过程中添加了Tween 80后，酶解效果提升更明显，96 h水解液中还原糖浓度达到17.36 mg/mL，与对照组相比提升了近三倍。

3 结论

通过前期高温液态水预处理、后期Tween 80辅助酶解对天然玉米芯进行酶催化降解实验，发现高温液态水预处理打破了天然玉米芯致密的结构，有效去除了半纤维素的物理屏障，使纤维素大量裸露，便于纤维素酶对其进攻并加以降解；纤维素酶解过程中合理添加表面活性剂Tween 80，有效屏蔽了木质素的非生产性吸附，改善了纤维素酶吸附-解吸附性质，减弱了产物抑制。二者相结合，最终水解液中还原糖的浓度得到了显著提高，有效提高了生物质的转化效率。

将二氧化碳转化为塑料组分的转化技术

化石燃料长期以来一直是塑料的前体，但内布拉斯加-林肯大学和欧洲合作者的新研究可能有助于将这个时代推向烟-二氧化碳时代。大气中完全来自化石燃料燃烧的二氧化碳浓度已从前工业化时代的280×10-6增加到今天的约410×10-6。这种趋势以及化石燃料的有限供应迫使研究人员探索用二氧化碳而不是用石油或天然气生产塑料的方法。

内布拉斯加州的Vitaly Alexandrov及其同事详细介绍了一种基于催化剂的技术，该技术可将二氧化碳转化为乙烯的量增加一倍，而乙烯是世界上最常见的聚乙烯的重要组成部分。化学和生物分子工程助教Alexandrov说：“二氧化碳的转化对帮助消除导致全球变暖和环境中其他有害过程的排放非常重要。铜已成为将二氧化碳转化为聚合物分子的催化化学反应的主要候选者，当施加电压时，就发生催化反应。但是一些铜基的设置未能将超过约15%的二氧化碳转化为乙烯，因产率太小而不能满足工业需求。”

因此，威尔士斯旺西大学的研究人员决定尝试用不同聚合物涂覆铜，以提高其效率。用聚丙烯酰胺聚合物涂覆铜后，他们发现铜泡沫塑料的转化率从13%上升到26%。Alexandrov和博士后研究员Konstantin Klyukin随后通过内布拉斯加州荷兰计算中心进行基于量子力学的模拟来帮助解释聚丙烯酰胺设法超越其他聚合物的原因。他们发现聚丙烯酰胺分解CO2并将其重新组装成一对结合的C-O化合物，然后在它进一步驱动化学反应时稳定新的分子，它们最终生成乙烯。Alexandrov说：“CO2是一个非常难处理的分子，因为它非常难打断的双键。这是尝试将CO2转化为其他分子时最具挑战性的部分。不要希望花费太多的能量来转化它，否则，就是一种低效率转化反应。”研究人员希望进一步提高效率，Alexandrov说，他们瞄准更大的目标是：将二氧化碳直接转化为能生产塑料袋、容器和薄膜的聚乙烯。Alexandrov说，“实验主义者要想从简单分子，如乙烯，用间歇反应合成非常复杂的分子。投入CO2催化剂，最终生成可以在商店销售的聚合物结构。但这些分子结构非常复杂。这是理解我们创造这种方法的第一步。”

（摘自中外能源2018年第9期）