雷公藤多苷对斑马鱼耳毒性及其防护初步观察△

唐旭霞 石涯 谌晶晶 徐慧芳 韩朝

斑马鱼侧线系统是由皮肤衍生的重要感觉器官，具有感觉周围环境中水流、水温、水压及听觉等功能[1],其侧线神经丘毛细胞在结构和功能上与哺乳动物的内毛细胞非常类似，是研究毛细胞发育、再生和凋亡的重要模型[2，3]。2005年，Ton等[4]首次采用斑马鱼模型来评估药物耳毒性，随后，Chiu等[5]使用斑马鱼模型从1 040种药物中筛查出21种耳毒性药物。2011年Hirosed[6]应用斑马鱼模型对美国批准的88种抗肿瘤药的筛查中发现13种药物具有耳毒性。结合斑马鱼身体透明的特点，利用DASPEI荧光染料进行活体听细胞染色，可为高通量药物耳毒性及听细胞保护剂研究提供基础。雷公藤是我国传统中医学中的一种常用中药，现代药理表明其具有抗肿瘤、抗炎以及免疫抑制等药理活性[7]。雷公藤提取物研制的制剂用于治疗类风湿性关节炎、白血病、肾病综合征、肿瘤等，取得了较好的疗效，并已被广泛认可[8]；然其性辛、苦寒，有大毒，为中国植物图谱数据库收录的有毒植物。在雷公藤众多毒性中，偶有对其耳毒性的报道[9],且仅仅提到听力减退，也无明确的实验数据。

本研究利用斑马鱼分别观察雷公藤多苷在不同浓度下对其听细胞的损伤情况，同时观察地塞米松及谷胱甘肽对雷公藤多苷诱导斑马鱼耳毒性是否具有保护作用，探讨雷公藤多苷对斑马鱼的耳毒性及其防护方法，为雷公藤的临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1实验动物 斑马鱼胚胎的繁殖以自然成对交配的方式进行。受精后6 hpf(即6小时)和 24 hpf对胚胎进行清理(移除已死亡胚胎)后，在 28 ℃条件下用养鱼用水孵育胚胎(养鱼用水水质：每1 L反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为 480～510 μs/cm；pH 为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6 mg/L CaCO3)，以受精后5天(5 dpf)的斑马鱼为研究对象[由于胚胎可以从自身的卵黄囊中获取营养物质，故在受精后9天内(9 dpf)无需喂食]。

1.2实验用药、仪器与试剂 雷公藤多苷片(浙江得恩德制药有限公司，10 mg/片，批号1307101B，用1%二甲基亚砜(DMSO)配制成浓度为20 mg/ml的储备液，-20 ℃保存)，庆大霉素(阿拉丁，批号39970，用超纯水配制成25 mg/ml的储备液，-20 ℃保存)。

荧光立体显微镜(Nikon AZ 100, Japan)；6孔板(Nest Biotech)；二甲基亚砜(DMSO，阿拉丁，批号1095515)；DASPEI染料(Sigma，批号109k1336)。

1.3实验方法

1.3.1确定雷公藤多苷的最大非致死浓度(MNLC) 用五个初始检测浓度(100、50、25、10、5 μg/ml)的雷公藤多苷饲养AB品系、5 dpf(受精后5天)斑马鱼，每个浓度均饲养15尾斑马鱼，饲养24 h结束后，统计各组的斑马鱼死亡数量，使用Graphpad prism 6.0统计学软件绘制最佳的浓度效应曲线，经过曲线拟合，并计算雷公藤多苷的LC1(MNLC)。

1.3.2评价雷公藤多苷的耳毒性 实验组：依据雷公藤多苷浓度效应曲线和最大非致死浓度的结果，选取4个浓度(MNLC、1/2 MNLC、1/4 MNLC、1/8MNLC)，每个浓度均饲养30尾AB品系、5 dpf斑马鱼，分别命名为MNLC组、1/2MNLC组、1/4MNLC组、1/8MNLC组。

阳性对照组(庆大霉素组)：给予庆大霉素2.5 μg/ml饲养30尾斑马鱼；空白对照组：1% DMSO饲养30尾；

药物处理24 h后，每组随机选取10尾斑马鱼，用听细胞特异性荧光染料DASPEI对斑马鱼进行染色，其中DASPEI染料终浓度为1 mM(DMSO1%)，染色1 h后，清洗三次。在荧光显微镜下观察听细胞的分布和排列，用图像处理软件进行图像分析，计算听细胞荧光强度(S)。

1.3.3评价谷胱甘肽对雷公藤多苷诱导耳毒性的保护作用 实验组分为二组：雷公藤多苷10.5 μg/ml单独饲养(雷公藤组)，谷胱甘肽450 μM预处理1 h后加入雷公藤多苷10.5 μg/ml(雷公藤+谷胱甘肽组)，各30尾斑马鱼；

阳性对照组分为二组：庆大霉素2.5 μg/ml单独处理(庆大霉素组)，谷胱甘肽450 μM预处理1 h后加入庆大霉素2.5 μg/ml(庆大霉素+谷胱甘肽组)，各30尾斑马鱼；

空白对照组：1% DMSO饲养，30尾斑马鱼；

以上各组共同处理24 h后，荧光染色及处理方法参照1.3.2。

1.3.4评价地塞米松对雷公藤多苷诱导耳毒性的保护作用 实验组：将雷公藤多苷10.5 μg/ml单独处理组按照地塞米松浓度分别为0、50、25、12.5 μM,各组均以相应浓度地塞米松预处理1 h后再加入雷公藤多苷饲养，每组30尾斑马鱼；

阳性对照组给予庆大霉素2.5 μg/ml+谷胱甘肽450 μM(庆大霉素+谷胱甘肽组)饲养，30尾；空白对照组：1% DMSO饲养，30尾；

以上各组共同处理24 h后，荧光染色及处理方法参照1.3.2。

1.4统计学方法 雷公藤多苷对斑马鱼听细胞的损伤率计算公式如下：

统计学分析采用方差分析和Dunnett’s T-检验，P<0.05为差异有统计学意义。

1.5实验动物的处死 实验完成后，按照美国兽医协会(AVMA)对动物麻醉处死的规范要求，用三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行过度暴露处理，从而将斑马鱼处死。

2 结果

2.1确定雷公藤多苷的MNLC 雷公藤多苷诱发的斑马鱼死亡率见表1，根据表1中的数据，用GraphPad6.0拟合浓度致死曲线，经过曲线拟合，求得雷公藤多苷的LC1=MNLC=21 μg/ml。

表1 不同浓度雷公藤多苷诱发的斑马鱼死亡率(n=15)

2.2定量评价雷公藤多苷的耳毒性 各药物处理5 dpf AB系斑马鱼24 h后，用DASPEI染料进行活体斑马鱼染色，听细胞与染料结合后，发绿色荧光。听细胞分布在侧线神经丘及头部(图1)。拍照后，用软件分析图2中红色部分中听细胞荧光强度，各组再进行统计分析。结果显示：庆大霉素2.5 μg/ml对听细胞损伤率达88.5%～89.5%，与空白对照组相比具有显著性差异(P<0.01)。雷公藤多苷低剂量2.625、5.5 μg/ml对听细胞损伤率分别为8.9%、10.9%，对听细胞有损伤趋势，但与空白对照组相比均无统计学差异(P>0.05)。雷公藤多苷高剂量10.5、21 μg/ml对听细胞损伤率分别为46.9%、92.4%，与空白对照组相比对差异均有显著统计学意义(P<0.01，P<0.01)(图1、2，表2)。

表2 空白对照组、庆大霉素组及不同浓度雷公藤多苷组相对荧光强度及听细胞损伤率

注：*与空白对照组比较，P<0.01

2.3谷胱甘肽对雷公藤多苷诱导耳毒性的保护作用 单独应用庆大霉素2.5 μg/ml(庆大霉素组)对斑马鱼听细胞损伤率达85.8%，谷胱甘肽干预后(庆大霉素+谷胱甘肽组)听细胞损伤率下降到55.2%，两者差异有显著统计学意义(P<0.01)；单独应用雷公藤多苷10.5 μg/ml对听细胞损伤率达52.5%，谷胱甘肽干预后，斑马鱼听细胞损伤率达81.8%，两者差异有显著统计学意义(P<0.01)(图3、表3)。

表3 各组应用或不用谷胱甘肽后DASPEI染色相对荧光强度及听细胞损伤率

注：*与空白对照组组比较，P<0.01；#与庆大霉素组比较，P<0.01；&与雷公藤组比较，P<0.01

2.4地塞米松对雷公藤多苷诱导耳毒性的保护作用 雷公藤多苷10.5 μg/ml对听细胞损伤率达52.5%(地塞米松用量为0 μM)，12.5、25.0、50.0 μM地塞米松干预后，各组(12.5、25.0、50.0 μM组)听细胞损伤率分别为64.2%、67.7%、60.8%，四组数据两两比较均无统计学差异(P>0.01)(图4、表4)。

表4 空白对照组、庆大霉素+谷胱甘肽组及不同浓度地塞米松处理后雷公藤多苷各组相对荧光强度和听细胞损伤率

注：*与空白对照组比较，P<0.01

3 讨论

3.1雷公藤多苷的耳毒性 雷公藤最早出现在清代赵学敏的著作《本草纲目拾遗》中，1969年去皮雷

图1 正常斑马鱼DASPEI染色后听细胞荧光强度图片(红色部分中绿色荧光为听细胞)

图2 雷公藤多苷对斑马鱼听细胞荧光强度的影响

图3 应用谷胱甘肽及雷公藤多苷后斑马鱼听细胞荧光强度

图4 应用地塞米松及雷公藤多苷后斑马鱼听细胞荧光强度

公藤根芯木质部分的煎剂首次被用于临床治疗类风湿性关节炎，揭开了雷公藤研究与临床应用的新篇章[10]。雷公藤多苷是由雷公藤去皮根木质部分的氯仿—乙醇提取物，一直以来，雷公藤制剂的药效和毒性都是众多专家学者争议的问题，雷公藤多苷在治疗糖尿病肾病[11]、类风湿性关节炎[12]、原发性肾病综合征[13]等疾病方面都具有良好的效果；与此同时，也有确凿的证据证明其具有肝毒性[14]、生殖系统毒性[15]、消化系统毒性[16]、肾毒性[17]等。所以雷公藤制剂的使用仍有不小的争议。本研究中对雷公藤多苷的浓度摸索实验结果明确了雷公藤多苷具有耳毒性，且雷公藤多苷对听细胞的损伤趋势存在剂量依赖关系，即随着剂量的增加，斑马鱼听细胞数量减少。

3.2谷胱甘肽对雷公藤多苷耳毒性的影响 还原型谷胱甘肽是谷氨酸、甘氨酸及半胱氨酸组成的三肽，是广泛存在于正常细胞的一种生理性物质[18]，以往的研究结果[19]明确庆大霉素等氨基糖苷类药物对耳、肾损伤的机制可能是通过JNK信号通路的过程。谷胱甘肽是体内的重要氧自由基清除剂，对氨基糖苷类药物引起的耳聋能起到一定的缓解作用。雷公藤多苷在临床中具有抗炎及免疫抑制双重作用，有研究表明，使组织内氧自由基的水平的升高[20，21]是雷公藤多苷毒性的重要原因；也有文献认为雷公藤多苷通过提高大鼠血清中抗氧化酶(SOD和GSH-px)的活性，降低脂质过氧化终极产物(MDA)活性，清除氧自由基[22]，从而对结肠黏膜起到保护作用。 由以上的不同观点可以看出，与庆大霉素不同的是，雷公藤多苷在不同的环境中会引起不同的组织反应。因此推测可能是由于雷公藤多苷中的某些成分与谷胱甘肽这类含有巯基的蛋白质结合，致使谷胱甘肽含量降低，氧自由基生成过多，抗氧化系统被损坏，从而出现了氧化应激反应，故从文中结果看，在加入谷胱甘肽后雷公藤多苷对斑马鱼的耳毒性不降反升。

3.3地塞米松对雷公藤多苷耳毒性的影响 地塞米松属于糖皮质激素，是耳科治疗中耳炎及突发性耳聋的常用药。地塞米松与细胞凋亡之间的关系较为复杂，有研究表明地塞米松可在体内、体外诱导胸腺细胞凋亡[23]。有学者在豚鼠耳蜗的研究中发现，地塞米松可以通过抑制诱导性一氧化氮合成酶使凋亡细胞明显减少[24]。本实验研究结果显示，地塞米松对雷公藤多苷耳毒性并无明显抑制作用，可能的原因有：①与耳毒性产生机制有关：顺铂等耳毒性药物的研究中明确了地塞米松可以清除这类耳毒性药物产生的活性氧而达到保护毛细胞的作用，而雷公藤多苷产生耳毒性的机制可能是药物在内耳积蓄、钙离子紊乱、代谢障碍等，故地塞米松无法在其耳毒性中发挥作用；②地塞米松给药方式：由于糖皮质激素靶向定位差的特点[25]，以往对地塞米松的给药方式使用的注射方式较多，包括在人体内也常使用鼓室注射，而本次试验仅仅使用了含有地塞米松的溶液，只有一部分药物到达内耳，可能需要使用显微注射的方式精确的内耳给药才更为有效；③地塞米松的剂量：本实验使用的地塞米松浓度分级较少，无法准确找出有效剂量，将在后续的研究中深入探索。

总之，本实验结果表明，雷公藤多苷具有耳毒性，且存在剂量依赖关系；地塞米松及谷胱甘肽两类常用药物对雷公藤多苷所致耳毒性无明显保护作用。雷公藤多苷是临床常见药，但对其耳毒性的研究在国内并不普遍，故本次研究对今后该药物的使用具有一定的指导意义。本实验不足之处在于仅仅使用荧光染色作为耳毒性是否发生的判断依据，不能从微观层面反映其耳毒性的发生机制，未来可以加入听力水平和分子生物学的研究数据全面深入探讨雷公藤多苷耳毒性的发生机制及其防治方法。