宠物犬布鲁氏菌的分离与16S rDNA序列鉴定

黄 萃，刘林峰，张祥华，邓贤才，邬向东*



宠物犬布鲁氏菌的分离与16S rDNA序列鉴定

黄 萃1，刘林峰2，张祥华2，邓贤才2，邬向东1*

（1. 江西农业大学 动物科学技术学院，江西 南昌 330045；2. 栢特佳宠兽医院，江西 南昌 330013）

从某疑似感染布鲁氏菌宠物犬全血中分离到一株细菌，对其进行纯化培养、染色镜检，PCR扩增其16S rDNA基因片段，将扩增的产物纯化后测序，用NCBI软件对测序结果进行同源性检索，结果显示其与布鲁氏菌同源性达到100%；应用DNAStar软件进行16S rDNA序列相似性分析，结果分离菌株与布鲁氏菌16S rDNA核苷酸序列相似性达99.6%～100%，表明分离菌株为布鲁氏菌。其分离菌株是犬种还是牛、羊种布鲁氏菌还需要进一步研究。

宠物犬；布鲁氏菌；16S rDNA

布鲁氏菌病(简称“布病”)是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患传染病，是一种严重的慢性变态反应性传染病[1]。布鲁氏菌是兼性胞内寄生的革兰氏阴性球杆菌，无芽胞，无鞭毛，不运动，具有强烈的致病性；对营养需求高，生长最适温度为37 ℃[2-3]。其根据抗原性和主要宿主分为9个种，21个型：猪布鲁氏菌（5个生物型：1、2、3、4、5）、牛布鲁氏菌（7个生物型：1、2、3、4、5、6、9）、羊布鲁氏菌（3个生物型：1、2、3）、绵羊附睾布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、沙林鼠布鲁氏菌、鳍布鲁氏菌、鲸布鲁氏菌和田鼠布鲁氏菌[4-5]。

羊、牛、猪种布鲁氏菌属于光滑型布鲁氏菌，均可感染人；犬种布鲁氏菌属于粗糙型菌株，主要感染犬类动物，临床上可引起母犬流产或不孕、公犬附睾炎等[5, 6]。猪、牛、羊布鲁氏菌也可感染犬，且多为隐性感染，1931年首次报道了猪布鲁氏菌感染犬的病例[7]。猪、牛、羊布鲁氏菌毒力强，感染犬后可作为传染源传染给人，而犬与人接触密切，因此对人类危害更大[8]。随着社会经济发展和人们生活水平的提高，人们饲养犬的数量逐年增多，从而人们与犬的接触越来越密切，导致犬布鲁氏菌病的发病数量和受感染人群逐年递增，该病对人类健康和公共卫生安全所带来的危害也日趋严重，应加大对其的研究与防治[9, 10]。

本试验对从宠物犬全血中分离到的一株疑似布鲁氏菌(命名为sp JX)进行纯化培养、染色镜检，采用PCR扩增其16S rDNA基因片段并进行测序，用NCBI软件对测序结果进行同源性检索，并用DNAStar软件进行16S rDNA序列相似性分析，最终确定该菌株为布鲁氏菌。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 病料及来源 来自于就诊江西农业大学兽医院的某疑似感染布鲁氏菌病的发病犬，从全血中分离得到该菌。

1.1.2 主要培养基及试剂 血琼脂培养基，由本实验室自制；PCR Mix、100 bp DNA Ladder，购自北京全式金生物科技有限公司；饱和酚、溴化乙锭（EB），购自上海生工生物工程股份有限公司；胶回收试剂盒，购自Omega公司；Tris碱，购自Solarbio公司；SDS、Agarose，购自Sigma公司。

1.1.3 主要设备 净化工作台(型号为SW-CJ)，购自苏州净化设备有限公司；立式压力蒸气灭菌器(型号为YXQ-LS-75S11)、生化培养箱(型号为SPX-150B-Z)，购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂；冷冻台式高速离心机(型号为5415R)，购自Eppendorf公司；PCR仪(型号为K960)，购自杭州晶格仪器有限公司。

1.1.4 引物设计 分离株的16S rDNA基因序列的扩增采用细菌16S rDNA通用引物，由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列如下：

16S(F)5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′，

16S(R)5′GGTTACCTTGTTACGACTT3′。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离 无菌取发病犬的全血涂布于血琼脂培养基，将培养基置于烛缸内，在37 ℃温箱中培养5~7 d后进行观察，挑取可疑单个菌落进行纯化培养。

1.2.2 染色镜检 分别勾取纯化培养的单个菌落进行涂片，经革兰氏染色和柯兹洛夫斯基染色，油镜镜检，观察记录其形态特征。

1.2.3 细菌16SrDNA鉴定 （1）细菌DNA提取。取1.5 mL规格离心管，加入无菌双蒸水100 μL，勾取上述纯化培养的菌落2接种环于离心管中，95~100 ℃煮沸10 min；12 000 r/min离心5 min，取上清，作为细菌DNA模板，-20 ℃保存备用[11]。

（2）细菌16SrDNA的PCR扩增。PCR反应体系：总体积为25 μL，其中含16S(F)和16S(R)各1 μL、PCR Mix 12.5 μL、DNA模板1 μL以及ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，34个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，30 min后在紫外灯下观察结果，并拍照记录。

（3）16S rDNA测序与序列分析。用胶回收试剂盒回收目的片段，将纯化回收的目的片段送至南京金斯瑞生物科技有限公司测序。运用NCBI基因库中的BLAST对分离株测序所得序列进行同源性检索和分析对比，并用DNAStar对分离株和NCBI上布鲁氏菌菌株16S rDNA基因序列进行相似性比对分析。相似性>99%定义为种，相似性在95%~99%则定义为属，相似性<95%则定义为科[12]。

2 结 果

2.1 染色镜检结果

结果表明，分离株经柯兹洛夫斯基染色为红色短杆状（图1），革兰氏染色为革兰氏阴性球杆菌（图2），初步怀疑其为布鲁氏菌。

2.2 细菌16S rDNA基因扩增结果

PCR扩增结果如图3，可见有一条清晰的DNA条带，大小约1 500 bp，与预期大小相符。

图1 柯兹洛夫斯基染色结果（10×100）

图2 革兰氏染色结果（10×100）

a为100 bp Marker，b为细菌16S rDNA

2.3 序列分析

分离株. sp JX测序所得目的序列大小为1 335 bp，与预期大小相符。. sp JX基因序列与NCBI基因库中的布鲁氏菌16S rDNA基因序列进行同源性分析对比，显示该序列与布鲁氏菌同源性达100%；用DNAStar对分离株. sp JX和NCBI上布鲁氏菌菌株16S rDNA基因序列进行相似性比对分析，结果显示与已知布鲁氏菌菌株16S rDNA基因序列相似性达99.6%~100%（图4）。

参考菌株为：羊布鲁氏菌（B. ovis）、流产布鲁氏菌（B. abortus）、猪布鲁氏菌（B. suis）、马尔他布鲁氏菌（B. melitensis）、犬布鲁氏菌（B. canis）、田鼠布鲁氏菌（B. microti）、红布鲁氏菌（B. inopinata）、帕皮布鲁氏菌（Brucella.）、狐狸布鲁氏菌（B. vulpis）

3 小结与讨论

布病常用检测方法主要包括细菌学和免疫学。传统的细菌学检测技术准确可靠，但操作繁琐，时间较长，且存在较大的实验室生物安全隐患[13]。核酸序列分析技术具有快速、准确、特异性强等优点，其中，16S rDNA序列分析技术已成为鉴定细菌种属的重要方法[14]。本试验运用16S rDNA序列同源性分析对疑似感染布鲁氏菌宠物犬进行了鉴定，确诊了宠物犬感染布鲁氏菌的病例，结果也进一步证实了16S rDNA序列同源性分析技术鉴定布鲁氏菌的准确性和可行性。

但是单纯的16S rDNA序列分析也有其缺点，上述通过对分离株. sp JX与各布鲁氏菌菌株16S rDNA基因序列进行相似性比对分析表明，单纯的16S rDNA序列分析不能对布鲁氏菌进行种和基因分型鉴定，因此需要进一步通过多重PCR、AMOS-PCR、Rep-PCR、MLST、MLVA技术[15]等方法对布鲁氏菌属做进一步种型鉴定。

布鲁氏菌病是世界性的人畜共患慢性传染病。目前，全球多个国家和地区仍广泛流行犬布鲁氏菌病[16]，且发病数量和受感染人群呈逐年上升趋势。犬种布鲁氏菌主要感染犬，猪、牛、羊以及人类对犬种布鲁氏杆菌易感性低。但犬可感染猪、牛、羊种布鲁氏菌，所以人类感染布鲁氏菌病的主要传播途径可能是接触了感染猪、牛、羊种布鲁氏菌的犬，且猪、牛、羊种布鲁氏菌毒力强，因此给人带来的危害更大。本次从流产犬中分离到布鲁氏菌提供了参考，但仍不能确定是牛、羊种或犬种布鲁氏菌，还需送检到微生物三级生物安全实验室进行进一步鉴定。

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Isolation of Brucella on Pet Dogs as well as Its 16S rDNA Sequence Identification

HUANG Cui1, LIU Lin-feng2, ZHANG Xiong-hua2, DENG Xian-cai2, WU Xiang-dong1*

(1. School of Animal Science and Technology, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China; 2. Partridge Veterinary Hospital, Nanchang 330013, China)

A strain of bacteria from the whole blood of a suspected Brucella-infected pet dog was isolated, purified, stained and microscopically examined, and the 16SrDNA gene fragment was amplified by PCR. The amplified product was purified and sequenced, and then NCBI software was used. The results showed that its homology with Brucella reached 100%; 16SrDNA sequence similarity analysis was performed by using DNAStar software, and it was found that the nucleotide sequence similarity between the isolated strain and Brucella 16S rDNA was between 99.6% and 100%, indicating that the isolated strain was Brucella, but whether the isolated strain wasorremains to be further studied.

pet dog; Brucella; 16SrDNA

S829.2

A

2095-3704（2018）04-0290-04

2018-11-01

2018-12-04

黄萃（1995—），女，硕士，主要从事动物病原及免疫学，1415365418@qq.com；

邬向东，副教授，dxywxd2006@126.com。

10.3969/j.issn.2095-3704.2018.04.60

黄萃, 刘林峰, 张祥华, 等. 宠物犬布鲁氏菌的分离与16S rDNA序列鉴定[J]. 生物灾害科学, 2018, 41(4): 290-293.