马铃薯软腐病菌室内药剂及拮抗细菌筛选

冯迪南，王梦瑶，余成鹏，刘琼光，2

（1. 华南农业大学农学院，广东 广州 510642；2. 广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室，广东 广州 510642）

马铃薯是我国第四大粮食作物，中国是世界上马铃薯第一生产大国。然而，马铃薯病害是影响马铃薯生产的一大障碍，其中马铃薯细菌性软腐病是大田生产和贮藏期发生最普遍且严重的病害之一［1］。引起马铃薯腐烂症状的病原菌种类主要包括果胶杆菌属（Pectobacterium）和迪克氏菌属（Dickeya）中的一些种［2］，其中Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense （简称Pcb）分布广泛，危害严重［3］。马铃薯作为广东省冬种作物，种植面积大。近年来，田间马铃薯细菌性软腐病逐年加重，病原细菌可侵染马铃薯的块茎、茎和叶，导致发病部位变黑、组织软腐、散发恶臭味，严重影响马铃薯产量和品质。目前，马铃薯软腐病防治的主要措施是以加强栽培管理为主的农业防治，且防治药剂种类较少［4］，生产上用于防治植物细菌病害的化学药剂是否对病原细菌Pcb都有效果，尚不十分清楚，因此，有必要筛选对Pcb有明显抑菌作用的理想药剂。此外，生物防治因其对环境友好、对人畜安全等诸多优点受到国际广泛重视，其中的生防细菌是防治植物病害的环保新选择，并且拮抗菌剂在生产实践中也取得了令人瞩目的成就，显示出巨大经济效益和广阔应用前景［5］，为此，分离筛选有效的拮抗细菌显得尤为重要。但是，迄今有关马铃薯软腐细菌的拮抗菌筛选以及软腐病的生物防治研究较少。

本研究以马铃薯软腐病菌Pcb菌株Po-2为指示菌，通过室内平板抑菌试验，筛选对Pcb抑菌作用较好的化学药剂，并探索不同药剂混配的作用效果，进一步筛选和鉴定对Pcb有较好抑菌效果的拮抗细菌，以期为马铃薯细菌性软腐病的化学防治和生物防治奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试病原菌为马铃薯软腐病菌Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis Po-2菌株，分离自广东省惠东县马铃薯产区，由华南农业大学细菌研究室保存并提供。

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL。以不加琼脂作为液体培养基。普通细菌培养基：牛肉膏3 g，酵母膏3 g，蛋白胨3 g，硫酸镁0.25 g，磷酸氢二钾2 g，磷酸二氢钾0.5 g，蔗糖15 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 mL。供试药剂选择国内马铃薯生产上防治植物细菌性病害的9种药剂，见表1。

表1 供试药剂及其有效成分和厂家

1.2 试验方法

1.2.1 单一药剂对马铃薯软腐病菌的平板抑菌试验 各药剂设置2个浓度，其中一个是药剂说明书上的使用浓度，另一个是该浓度的3倍稀释液，利用平板打孔方法，测定9种药剂对Pcb的抑菌作用。方法如下：将Po-2单菌落接种于10 mL LB培养液中，30℃培养24 h，调整OD600约为0.5，并取1 mL菌液加入到100 mL融化的（约45℃）LB固体培养基中，充分混匀后，倒入灭菌培养皿中，制成含Pcb指示菌Po-2平板，凝固后用7 mm打孔器在平板上打孔，在孔内加入50 μL药剂，每个药剂浓度3次重复，以无菌水作对照。30℃培养24 h后，测量抑菌圈大小。

1.2.2 混合药剂对马铃薯软腐病菌的平板抑菌试验 挑选单一药剂抑菌作用效果较好的药剂，以1∶1进行两两混配，进行平板抑菌试验，方法同1.2.1。

1.2.3 马铃薯软腐病菌拮抗细菌分离和筛选土壤细菌分离 土壤样本采集于华南农业大学校园及周边环境的植物根际，土壤细菌分离方法为：称取10 g土壤于锥形瓶中，加入50 mL无菌水，充分搅拌，静置15～20 min，取上清液进行10倍梯度稀释，而后取100 μL稀释液均匀涂布在普通细菌培养基平板上，30℃培养24～48 h，挑取不同形态单菌落，多次纯化，备用。

拮抗细菌平板筛选：将上述已纯化的细菌菌株接种于10 mL LB中，30℃培养24 h，调整OD600约为0.5，然后取3 μL点接在新制备的Po-2平板上，方法同1.2.1。30℃培养24～48 h，测定抑菌圈大小。

1.2.4 拮抗细菌16S rDNA初步鉴定 对筛选出的拮抗细菌，采用细菌的通用引物E8F/ATCGTGCCCATCGATCACTG和1541R/CATGGATCGTCATAAAGCT，PCR扩 增 16S rDNA片段，25 μL PCR反应体系为：PCR缓冲 液 2.5 μL、dNTPs 2 μL、引物各1 μL、TaqDNA聚合酶0.4 μL、双蒸水17.1 μL、模板1.0 μL。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸 1.5 min，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测和纯化后，送上海英潍捷基生物技术公司测序，并将序列在NCBI网站上进行核酸序列Blast比对，选取同源性较高的序列用MEGA5.0软件构建系统发育进化树。

2 结果与分析

2.1 万胜清、克菌康、辛菌胺醋酸盐、金霉唑等药剂对马铃薯软腐病菌具有较好抑菌作用

平板抑菌试验结果（图1）表明，9种药剂中对软腐病菌Po-2的抑菌作用存在差异，其中万胜清（20%溴菌腈·5%壬菌铜）800倍抑菌圈直径最大、平均为24.50 mm，稀释2 400倍后抑菌圈直径仍有19.33 mm；克菌康（3%中生菌素）600倍的抑菌圈直径5.92 mm，稀释1 800倍后抑菌圈直径为3.67 mm；1.2%辛菌胺醋酸盐稀释200倍和600倍，其抑菌圈直径分别为7.58和3.58 mm；金霉唑（1.5%噻霉酮）稀释600倍和1 800倍，其抑菌圈直径分别为6.08和2.25 mm。然而，碧生（20%噻唑锌）、龙克菌（20%噻菌铜）、兴农（33.5%喹啉铜）、可杀得叁仟（46%氢氧化铜）和铜高尚（27.12%碱式硫酸铜）等5种药剂，在它们最小稀释倍数范围内对Po-2均没有抑菌作用，抑菌圈直径均为0.00 mm（表2）。4种药剂最大稀释度的抑菌试验结果表明，对马铃薯软腐病菌的抑菌效果表现为万胜清＞克菌康＞辛菌胺醋酸盐＞金霉唑。

图1 药剂万胜清在Po-2平板上产生的抑菌圈

表2 9种药剂对马铃薯Pcb菌株Po-2的平板抑菌圈直径

2.2 辛菌胺醋酸盐和万胜清混配对马铃薯软腐病菌的抑菌效果

将抑菌效果较好的辛菌胺醋酸盐和万胜清两种药剂混配，平板上测定对马铃薯软腐病菌Po-2的抑菌作用，结果发现，辛菌胺醋酸盐和万胜清混配后抑菌圈直径为25.67 mm，而单独辛菌胺醋酸盐抑菌圈直径为9.17 mm，单独万胜清抑菌圈直径为26.42 mm，表明这两种药剂混配后并不能提高抑菌效果。

2.3 马铃薯软腐细菌拮抗细菌的分离和拮抗效果测定

从不同植物根际土壤中共分离出150个细菌菌株，通过平板抑菌试验，得到5个细菌菌株对马铃薯软腐细菌Po-2有抑菌作用，其抑菌圈直径在2.75～3.83 mm之间（表3），其中拮抗菌RFjk2的抑菌作用最明显（图2）。

表3 5个拮抗细菌对软腐病菌Po-2的平板抑菌圈大小

图2 拮抗细菌RFjk2和RFjk3对马铃薯软腐病菌Po-2的平板抑菌作用

2.4 5个拮抗细菌16S rDNA序列分析和初步鉴定

进一步对这5个菌株进行16S rDNA测序，采用细菌通用引物E8F/1541R PCR扩增16S rDNA片段，其目的片段大小均为1.5 kp大小。扩增产物测序后，将获得的序列在NCBI网 站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi） 进行BLAST同源性检索，计算所测定的5个菌株的16S rDNA全序列遗传距离，对5个菌株经MEGA4软件统计，采用邻接法（NJ法）分别构建5个拮抗细菌的系统发育树（图3～图7）。

表4 5个拮抗细菌16S rDNA序列BLAST和初步鉴定结果

结果表明，拮抗菌RFjk1与菠萝泛生菌Pantoea ananatis 菌株SGAir0210（基因编号：CP028033.1）的16S rDNA序列同源性为99%，初步鉴定为泛生菌属（Pantoea）（图3、表4）；拮抗菌RFjk2与粘质沙雷氏菌Serratia marcescens 菌株EG5（基因编号：KU321349.1）的16S rDNA序列同源性为100%，鉴定为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）（图4、表4）；拮抗菌RFjk3与杀变形假单胞菌Pseudomonas plecoglossicida RD_MAAMIA_05（基因编号：KU597532.1）的16S rDNA序列同源性为99%，初步鉴定为假单胞菌属（Pseudomonas）（图5、表4）；拮抗菌RFjk4和RFjk5与松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciuri（基因编号：LS483305.1和JX134627.1）的16S rDNA序列同源性为99%，初步鉴定为葡萄球菌属（Staphylococcus）（图6～图7、表4）。

图3 拮抗细菌RFjk1基于16S rDNA序列的系统发育树

图4 拮抗细菌RFjk2基于16S rDNA序列的系统发育树

图5 拮抗细菌RFjk3基于16S rDNA序列的系统发育树

图6 拮抗细菌RFjk4基于16S rDNA序列的系统发育树

图7 拮抗细菌RFjk5基于16S rDNA序列的系统发育树

3 结论与讨论

迄今，国内外防治作物细菌性病害的新型化学药剂种类较少，且大多数以铜制剂为主［6］，然而，同一成分的杀细菌剂并非对所有植物病原细菌都有抑菌或杀菌作用。本研究通过室内平板抑菌试验，发现国内市场上使用的9种杀细菌药剂对马铃薯软腐病菌Pcb的抑菌效果差异较大，其中万胜清（20%溴菌腈·5%壬菌铜）、克菌康（3%中生菌素）、辛菌胺醋酸盐、金霉唑（1.5%噻霉酮）等4种药剂对Pcb菌株Po-2抑菌效果较好，而碧生（20%噻唑锌）、龙克菌（20%噻菌铜）、兴农（33.5%喹啉铜）、可杀得叁仟（46%氢氧化铜）、铜高尚（27.12%碱式硫酸铜）等5种药剂在其使用浓度范围内对Po-2均没有抑菌作用。

噻霉酮主要用于防治真菌病害，未报道其对软腐病细菌有作用，本研究发现，1.5%噻霉酮对马铃薯软腐菌Pcb具有抑菌效果。辛菌胺醋酸盐是一种广谱性杀菌剂，对一些真菌、细菌及病毒病害均有一定的防治效果［7-9］，中生菌素和溴菌·壬菌铜较多地应用于植物细菌病害防治［10-11］。由此，我们认为，田间防治Pcb引起的作物细菌性软腐病，可推荐使用万胜清（20%溴菌腈·5%壬菌铜）、中生菌素、辛菌胺醋酸盐和金霉唑（1.5%噻霉酮）等药剂，万胜清和辛菌胺醋酸盐混配并不能提高抑菌效果，不建议在生产上混合使用，但可以轮换使用，还需要进一步的田间试验。

噻唑锌是新一代高效、低毒、安全的有机锌杀菌剂，20%噻唑锌对水稻黄单胞杆菌（Xanthomonas oryzae）、大白菜软腐病菌（Pectobacterium carotovorum subsp. carotovora）有较好的抑菌作用和病害防治效果［12-13］；噻菌铜可用于烟草野火病、柑桔溃疡病、姜瘟病等细菌病害的防治［14-15］；喹啉铜则可用于防治黄瓜细菌性角斑病，且与烯酰吗啉混和使用，效果更佳［16］；其他几种铜制剂，如可杀得三仟、铜高尚等有报道用来防治水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病和稻曲病等［17-19］。然而，本研究却发现，噻菌铜、喹啉铜、氢氧化铜和碱式硫酸铜等铜制剂，在它们的使用浓度范围内，均不表现对马铃薯软腐细菌Pcb的平板抑菌和杀菌作用，原因可能由于这些铜制剂本身对Pcb作用效果差，也可能生产上大量使用这些铜制剂，病菌已经产生了抗药性，需要进一步研究。

目前，针对由Pcb引起的细菌性软腐病的生物防治研究极少，本研究从土壤中分离获得5个对软腐细菌Pcb具有抑菌效果的拮抗细菌，16S rDNA序列分析表明，它们分别与菠萝泛生菌（Pantoea ananatis）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）及松鼠葡萄 球 菌（Staphylococcus-sciuri） 的 16SrDNA序列相似性在99%以上。有研究表明，泛生菌属Pantoea细菌对茄链格孢（Alternaria solani）、辣椒枝孢（Cladosporium capsici）、稻梨孢菌（Pyricularia oryzae）、甘薯长喙壳菌（Ceratocystis fimbriata）、西瓜壳二孢（Ascochyta citrullina）等病原真菌有抑菌效果［20］，成团泛菌（Pantoea agglomerans）对志贺氏菌（Shigella castellani）、大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（salmonella enteritidis）等病原细菌有抑制作用［21］。本研究分离得到的拮抗菌RFjk1初步鉴定为菠萝泛生菌（Pantoea ananatis），该细菌可引起多肉叶片细菌性褐腐病［22］，但鲜见有抑菌作用的报道；拮抗菌RFjk3、RFjk4和RFjk5初步鉴定为变形假单胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）和松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri），变形假单胞菌作为自然界的常见菌，对多种污染物有较强的分解能力，常被用于污水处理［23］，同时也引起大黄鱼疾病［24］；松鼠葡萄球菌广泛分布于自然界，为条件性致病菌，可感染人及多种动物［25］，较少报道对植物病原细菌具有抑菌作用，这3个拮抗菌能否有效用于马铃薯软腐病的生物防治，以及它们对环境的潜在风险性，需要进一步研究。

有报道显示，粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）对尖孢镰刀菌引起的黄瓜枯萎病有防治效果［26］，从魔芋中分离的粘质沙雷氏菌对魔芋软腐病菌（Pectobacterium carotovora subsp.carotovora和Pectobacterium chrysanthemi）有拮抗作用［27］，因此，粘质沙雷氏菌用于植物病害生物防治具有较大潜力。本研究分离获得的具有最大抑菌圈的拮抗细菌RFjk2属于粘质沙雷氏菌，这将为马铃薯软腐病的生物防治应用奠定基础。