糖厂滤泥堆肥发酵过程中可培养芽孢杆菌种群动态变化研究

刘 波，陈倩倩，王阶平，陈 峥，邓文琼，刘 欣，肖 谦，唐国梁

（1.福建省农业科学院农业生物资源研究所，福州 350002；2.豫园生物科技有限公司，长沙 410001）

广西是我国甘蔗主要产区，机制糖产量超过我国机制糖年总产量的2/3，制糖产业是广西不争的经济大户，也是环境污染大户。据推算，每产1 t糖排出的废糖蜜为0.27 t，滤泥占到压榨总量的2%；全国每年产糖量为800万t，产生废糖蜜216万t，滤泥16万t，排出污水量640万t[1]。一个年产10万t蔗糖的中等规模的糖厂，其COD总量相当于一个50万人口的中等城市排放的生活污水中的COD总量。就广西而言，排放到江河中的COD总量有70%来自糖厂，对河水的水质及周围的环境造成很严重的污染，水域的生态平衡和水资源的应用也受到很大的影响[2]。

国内外在处理蔗渣和糖厂滤泥方面提出了许多方法。在国外，Kumar等[3]利用微生物处理和蚯蚓后处理堆肥发酵甘蔗废弃物形成有机肥；Pérez等[4]利用分枝杆菌（Mycobacteria）处理糖厂滤泥将植物甾醇（Phytosterols）转换为雄烷（Androstanes）；Rocky-Sali⁃mi等[5]利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis K46b）发酵糖蜜生产植酸酶；Veana等[6]利用黑曲霉（Aspergillus niger GH1）固体发酵糖蜜和蔗渣生产蔗糖酶；Poo⁃pathi等[7]利用蔗渣发酵生产杀蚊生物农药苏云金芽孢 杆 菌（Bacillus thuringiensis subsp.israelensis）；Techapun等[8]设计了连续流加培养装置，利用放线菌（Streptomyces sp.Ab106）发酵糖厂滤泥等农业废弃物生产木聚糖酶（Xylanase）。在国内，糖厂滤泥处理有过许多研究，谭宏伟[9]将糖厂滤泥堆肥发酵制成生物有机肥；左见军等[10]综述了甘蔗糖厂滤泥的资源化利用，糖厂滤泥综合利用可概括为滤泥生产复合肥、加工成动物饲料、提取蔗蜡及植物固醇、制备材料及添加剂、作为生物质燃料等5个方面。蒙世协等[1]研究了亚硫酸法糖厂滤泥对生土熟化改良试验，施用亚硫酸法滤泥处理和亚硫酸法滤泥+复合微生物菌处理的土壤有机质提高，甘蔗发芽生根快，出苗率高。刘晓举等[11]利用糖厂滤泥生产根瘤菌菌剂，分析优化了大豆根瘤菌在滤泥中生长的最佳条件：温度29℃，pH 7.5，总糖总氮比7∶10，湿度72.97%，接种量51.3 mL·kg-1，脱水滤泥可以作为根瘤菌生长的载体。黄飒等[12]将碳酸法糖厂滤泥与酸性土壤混合后用于甘蔗种植试验，探索碳酸法糖厂滤泥资源再利用，解决滤泥填埋环境污染问题。虎玉森等[13]利用等离子体发射光谱（ICP）法、分光光度法和容量分析等方法，测定了糖厂滤泥中的金属元素、全磷、有效磷、全氮和有机质含量，说明了糖厂滤泥进一步开发利用的价值。

糖厂滤泥堆肥发酵生产有机肥被广泛采用。谭宏伟[9]采用功能菌发酵糖厂滤泥生产生物有机肥的腐熟速度快，受环境因素影响较小，发酵效果稳定，发酵温度最高达77.2℃，且70.0～77.2℃的维持时间长达12 d；发酵后的有机质含量和有机酸转化率优势明显，分别较传统（自然）发酵提高30.2%和12.3%（绝对值）。农业废弃物堆肥发酵过程中，微生物起着重要的作用。Wang等[14]报道了餐厨垃圾发酵过程添加石灰和磷酸氨镁（鸟粪石），可促进微生物生长和消除臭味。Zhong等[15]比较了接种剂添加与否对牛粪发酵的影响，研究表明接种与否影响较小，增加垫料对发酵有利，发酵过程中的优势种群为芽孢杆菌等厚壁菌门的微生物。Zhao等[16]研究了堆肥过程腐殖质降解菌对腐殖质电子传递基团（lkyl C，O-alkyl C，aryl C，car⁃boxylic C，aromatic C）的响应，影响着堆肥发酵过程，调节电子传递基团，可以调节堆肥发酵过程。许多研究表明，堆肥发酵过程中芽孢杆菌是优势微生物[17-21]。芽孢杆菌具有较高的抗逆性（耐高温、耐高盐、耐酸碱、抗紫外线等），在各种土壤中的生存能力较强[22]；同时能分解有机质，解磷解钾，提供作物生长养分，分泌许多抗病、生根、促长的次生代谢物[23]，在生物肥料和生物农药中广泛应用。作者选用芽孢杆菌作为糖厂滤泥堆肥发酵过程研究的微生物指标，对于揭示堆肥生产生物有机肥耐热微生物种群变化具有重要意义。关于糖厂滤泥生物有机肥堆肥发酵过程芽孢杆菌种群变化动态的研究未见报道。

作者利用堆肥发酵方法，经过好氧发酵，加速了对糖厂滤泥的除臭、腐熟、脱水、杀虫和灭菌，高温堆肥有效杀灭滤泥中夹带的病原菌、虫卵和杂草籽等，降解有毒有害物质；将糖厂滤泥堆肥发酵加工成生物有机肥，用于果树、瓜类、粮油、蔬菜、花卉等的基肥和追肥。为了解糖厂滤泥堆肥发酵加工生物有机肥生产过程中的芽孢杆菌种群动态，通过采样、分离、计数、纯化、鉴定，对其进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）样本采集：糖厂滤泥生物有机肥生产厂家为龙州南华长丰生物有机肥有限公司。堆肥发酵工艺：利用铲车把滤泥堆成高1.5 m、底宽4 m、长182 m的长条形堆垛，平均每3 d用翻堆机翻抛1次，发酵周期60 d，糖厂滤泥腐熟后，粉碎，混合化学肥料N∶P∶K=12%∶5%∶8%，经过圆盘造粒，烘干形成商品。发酵加工过程的采样：于糖厂滤泥堆垛的第1 d（AUG-L，浅发酵）、第30 d（AUG-M，中发酵）、第60 d（AUG-H，深发酵）、混合化学肥料后（AUG-F1，添化肥）、造粒后（AUGF2）分别采样，同时，采集堆肥旁边空地土壤；各采样点采用五点取样法，各取500 g，混合后共2500 g样本，放入冰箱保存备用。样品信息见表1。

（2）试剂仪器：芽孢杆菌采用LB培养基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，氯化钠5.0 g，pH 7.2～7.4，琼脂15.0 g，水1.0 L。PCR扩增引物采用细菌通用16S rRNA引物27F（5′-GAG TTTGAT CCT GGC TCA G-3′）和 1492R（5′-ACG GCT ACCTTG TTA CGA CTT-3′），由上海生物工程有限公司合成。PCR反应试剂：Mix[含 10×Buffer，dNTP（10 mmol·L-1），Taq 酶（2.5 U·μL-1）]（上海博尚生工生物工程技术服务有限公司），100 bp Marker（上海英骏生物技术有限公司）。DNA提取试剂：100 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1Tris/HCl，1 mmol·L-1EDTA，Tris-saturated phenol，氯仿。仪器：UVP GelDoc-It TS Imaging System凝胶成像仪、华粤行仪器有限公司Tpersonal Biometra梯度PCR仪、PowerPac Basic BIO-RAD电泳仪、离心机（Eppendorf Centrifuge 5418R）。

1.2 实验方法

1.2.1 芽孢杆菌分离

从各样本中取样10 g至90 mL的无菌水中，摇床30℃，170 r·min-1振荡30 min充分混合，配成10%浓度的样本悬浮液；采用刘国红等[24]加热筛选法加以改进，将悬浮液放置到80℃的水浴中加热10 min，杀死细菌菌体保存芽孢；采用张艳等[25]活菌计数法加以改进，将样品梯度稀释后（10-3、10-4、10-5），涂布LB培养基的平板上，放置于30℃培养箱培养，2 d后观察培养皿上的菌落，根据菌落大小、形态、颜色对相同类型的菌落进行编号和计数，分离纯化不同编号的菌株，用16S rDNA基因对编号菌株进行种类鉴定，获得芽孢杆菌种类，排除非芽孢杆菌进行活菌数的统计。每个样本重复3次，分离纯化菌株采用-80℃甘油冷冻法进行保存，采用Tris-饱和酚法提取芽孢杆菌基因组DNA，采用通用细菌16S rRNA引物进行扩增、测序、鉴定。

表1 蔗糖压榨糖厂滤泥堆肥发酵生产生物有机肥过程样品信息Table 1 Information of the samples in the process of sugar-refinery filtering mud composting fermentation to produce bio-organic fertilizers

1.2.2 芽孢杆菌种类鉴定

细胞悬浮液制备：于1.5 mL EP管中加入400 μL STE缓冲液，用刮菌环从平板中刮取少量已纯化好的菌落，混匀。DNA提取：1 mL的细胞悬液在8000 g下离心2 min，弃去上清液后用400 μL STE缓冲液冲洗细胞两次，8000 g离心2 min，弃去上清液（若为平板，则400 μL STE悬浮，离心，弃上清液）。用200 μL TE缓冲液悬浮细胞，然后用100 μL的Tris-饱和酚（取下层）加到离心管中，涡旋混合60 s（振荡用浮板）。在4℃下13 000 g离心5 min以从有机相中分离出水相，取160 μL上清液转移到干净的1.5 mL EP管中。加40 μL TE缓冲液到EP管中，用100 μL氯仿混合，4 ℃13 000 g离心5 min，用氯仿提取的方法纯化裂解，直到没有白色的界面出现，此过程重复2～3遍，每次直接往里加100 μL氯仿，离心。取160 μL上清液到干净的1.5 mL EP管中，再加40 μL TE缓冲液在37℃下放置10 min，以分解RNA。将100 μL氯仿加到离心管中混匀后，在4℃下13 000 g离心5 min。将150 μL上清液转移到干净的1.5 mL EP管中，此时的上清液包含有纯化的DNA，且可以直接用于序列实验，并可在-20 ℃保存。PCR反应体系：ddH2O：9.5 μL、Mix：12 μL、正向引物：1 μL、反向引物：1 μL、DNA：1.5 μL；PCR扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55 ℃退火60 s，72℃延伸90 s，共30个循环；最后72℃延伸10 min，10℃保存。PCR产物检测：取5 μL PCR产物，点样于1%的琼脂糖凝胶中，以100 bp Marker作为标准分子量，110 V电压，电泳30 min，用凝胶成像系统观察结果。测序：检测出有条带的菌株PCR产物送至铂尚生物技术有限公司进行测序。16S rRNA序列分析：将所得序列在细菌序列比对网站EZtaxon-e.ezbiocloud.net上进行序列比对分析后，参照刘波等[26]发表的芽孢杆菌属及其近缘属种名目录，标明中文名称。

1.2.3 糖厂滤泥发酵过程芽孢杆菌种群动态分析

（1）统计糖厂滤泥堆肥发酵过程各阶段（AUGL-第1 d浅发酵，AUG-M-第30 d中发酵，AUG-H-第60 d深发酵，AUG-F1-复合化学肥料后，AUG-F2-添化肥造粒后）芽孢杆菌活菌总数，进行种群数量变化动态分析比较；（2）分析糖厂滤泥堆肥发酵过程各阶段芽孢杆菌不同种类和数量的结构变化，利用种类变更率（%）（与上一阶段相同种类的个数/该阶段种类总个数），统计各阶段与上一个阶段相同种类芽孢杆菌变更的情况，如果该阶段与上阶段相同种类个数多，变更率就低，反之就高，分析种类结构变化的程度。（3）利用靠近发酵场地的本地土壤分离的芽孢杆菌种类与糖厂滤泥中分离的种类进行比较，分析糖厂滤泥堆肥发酵过程芽孢杆菌与本土芽孢杆菌的关系。

2 结果与分析

2.1 糖厂滤泥堆肥发酵过程芽孢杆菌种类鉴定

从糖厂滤泥堆肥发酵生产生物有机肥过程的6个样品中共分离到64株芽孢杆菌（表2），分属于7个属，27种，其中芽孢杆菌属（Bacillus）16种、哈格瓦氏菌属（Bhargavaea）1种、纤细芽孢杆菌属（Gracilibacil⁃lus）1种、赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）1种、大洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）3种、鸟氨酸芽孢杆菌属（Ornithinibacillus）2种、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）2种、枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）1种。芽孢杆菌属占有绝对优势。

2.2 糖厂滤泥堆肥发酵过程的芽孢杆菌种类系统发育及中国新纪录种的发现

在糖厂滤泥堆肥发酵加工过程中分离的芽孢杆菌可聚类为4类（见图1），第1类主要类群是以芽孢杆菌属为主的种类，包含了18个种；第2类主要类群为大洋芽孢杆菌属、鸟氨酸芽孢杆菌属、枝芽孢杆菌属的种类，包含了6个种；第3类主要类群为赖氨酸芽孢杆菌属的种类，包含1个种；第4类主要为类芽孢杆菌属的种类，包含2个种。其中，有6种芽孢杆菌在国内未见报道，为我国新纪录种，它们是：（1）大豆发酵芽 孢 杆 菌 Bacillus glycinifermentans（FJAT-47935、FJAT-47944、FJAT-47907），（2）外村尚芽孢杆菌Ba⁃cillus hisashii（FJAT-47926），（3）科研中心哈格瓦氏菌Bhargavaea cecembensis（FJAT-47948）（属于芽孢杆菌目、动球菌科、哈格瓦氏菌属），（4）苯乙酮赖氨酸芽孢 杆 菌 Lysinibacillus acetophenoni（FJAT-47912、FJAT-47934、FJAT-47919），（5）巴伐利亚鸟氨酸芽孢杆菌Ornithinibacillus bavariensis（FJAT-47915），（6）拾蛤鸟氨酸芽孢杆菌（Ornithinibacillusscapharcae FJAT-47951）。

2.3 糖厂滤泥堆肥发酵过程中芽孢杆菌数量与种群结构动态变化

糖厂滤泥堆肥发酵过程芽孢杆菌数量的动态变化，见图2。在糖厂滤泥不同发酵加工阶段，可培养芽孢杆菌数量差异显著（P＜0.01**），糖厂滤泥堆肥发酵初始阶段（AUG-L，浅发酵，1 d）芽孢杆菌总含量114万cfu·g-1；随着发酵进程进入发酵中期（AUG-M，中发酵，30 d），总含量上升了107.89%，为237万cfu·g-1；随着糖厂滤泥堆肥发酵腐熟进入深发酵阶段，总含量下降了84.13%，为37.6万cfu·g-1；腐熟糖厂滤泥添加化肥混合后，芽孢杆菌数量有所回升，总含量为152万cfu·g-1；经过圆盘造粒干燥后，产品中的芽孢杆菌数量大幅度下降到43万cfu·g-1。

表2 糖厂滤泥微生物肥料生物有机肥堆肥发酵过程芽孢杆菌分离鉴定Table 2 Isolation and identification of the Bacillus-like species from the samples in the process of sugar-refinery filtering mud composting fermentation to produce bio-organic fertilizers

糖厂滤泥堆肥发酵过程中芽孢杆菌种群结构动态变化见图3。糖厂滤泥堆肥发酵初始阶段（AUGL，浅发酵，1 d）分离到8种芽孢杆菌，总含量为114万cfu·g-1，优势种为 Bacillus glycinifermentans FJAT-47935（大豆发酵芽孢杆菌）（36万cfu·g-1）和Bacillus tequilensis FJAT-47943（特基拉芽孢杆菌）（25万cfu·g-1）；其中，Bacillus glycinifermentans FJAT-47935为我国新纪录种。

糖厂滤泥堆肥发酵中期阶段（AUG-M，中发酵，30 d），堆垛发酵30 d，分离到10种芽孢杆菌，总含量为237 × 104cfu·g-1，优势种为Oceanobacillus polygoni FJAT-47932（蓼蓝大洋芽孢杆菌）（128万cfu·g-1）和Oceanobacillus halophilum FJAT-47931（嗜盐大洋芽孢杆菌）（72万cfu·g-1）；其中，Lysinibacillus acetophe⁃noni FJAT-47934（苯乙酮赖氨酸芽孢杆菌）为我国新纪录种。

图1 基于16S rRNA基因序列的糖泥生物有机肥发酵过程芽孢杆菌系统发育树Figure 1 Phylogenetic tree of the Bacillus-like species from the samples in the process of sugar-refinery filtering mud composting fermentation to produce bio-organic fertilizers based on the 16S rRNA gene sequences

糖厂滤泥堆肥发酵腐熟阶段（AUG-H，深发酵，60 d），堆垛发酵60 d，分离到6种芽孢杆菌，总含量为37.6万 cfu·g-1，优势种为 Oceanobacillus caeni FJAT-47952（淤泥大洋芽孢杆菌）（10.7万cfu·g-1）和Paeni⁃bacillus harenae FJAT-47953（沙漠沙类芽孢杆菌）（10.2万 cfu·g-1）；其中，3个种即 Ornithinibacillus scapharcae FJAT-47951（拾蛤鸟氨酸芽孢杆菌）、Bhar⁃gavaea cecembensis FJAT-47948（科研中心哈格瓦氏菌）、Bacillus glycinifermentans FJAT-47944（大豆发酵芽孢杆菌）为我国新纪录种。

图2 糖厂滤泥堆肥发酵过程芽孢杆菌种群数量变化动态Figure 2 Dynamic changes in population quantity of the Bacilluslike species in the samples in the process of sugar-refinery filtering mud composting fermentation

糖厂滤泥腐熟料混合化肥加工阶段（AUG-F1，添加化肥），堆垛发酵腐熟后，添加化肥成分（N∶P∶K=15%∶5%∶8%），造粒前分离到8种芽孢杆菌，总含量为152万cfu·g-1，优势种为Oceanobacillus caeni FJAT-47911（淤泥大洋芽孢杆菌）（43万cfu·g-1）和Bacillus glycinifermentans FJAT-47907（大豆发酵芽孢杆菌）（42万cfu·g-1）；其中3个种，即Bacillus glycinifermen⁃tans FJAT-47907（大豆发酵芽孢杆菌）、Ornithinibacil⁃lus bavariensis FJAT-47915（巴伐利亚鸟氨酸芽孢杆菌）、Lysinibacillus acetophenoni FJAT-47912（苯乙酮赖氨酸芽孢杆菌）为我国新纪录种。

糖厂滤泥腐熟料造粒加工阶段（AUG-F2，造粒产品），堆垛发酵腐熟后，添加化肥，进行圆盘造粒，从造粒产品中分离到8种芽孢杆菌，总含量为43万cfu·g-1，优势种为 Bacillus thermotolerans FJAT-47921（耐温芽孢杆菌）（11万 cfu·g-1）和 Bacillus farraginis FJAT-47917（混料芽孢杆菌）（9万cfu·g-1）；其中，Ba⁃cillus hisashii FJAT-47926（外村尚芽孢杆菌）为我国新纪录种。

2.4 糖厂滤泥堆肥发酵过程芽孢杆菌与本土芽孢杆菌关系

实验结果见表3。从糖厂滤泥堆肥发酵堆场周围土壤中分离到芽孢杆菌7种，总含量为215万cfu·g-1，优势种为Bacillus pumilus FJAT-47966（短小芽孢杆 菌）（65万 cfu·g-1）和 Bacillus galactosidilyticus FJAT-47969（解半乳糖苷芽孢杆菌）（41万cfu·g-1），未发现我国新纪录种。本地土壤样品中的短小芽孢杆菌、高地芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、产硫芽孢杆菌在糖厂滤泥堆肥发酵过程未发现，而解半乳糖苷芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，可以在糖厂滤泥堆肥发酵加工过程中看到；糖厂滤泥中的许多芽孢杆菌，在本地土壤中未分离到，本土芽孢杆菌对糖厂滤泥堆肥发酵的影响较小，其发酵过程中出现的芽孢杆菌主要来源于自带种类。

图3 糖厂滤泥堆肥发酵过程芽孢杆菌种类结构变化动态Figure 3 Dynamic changes in population structure of the Bacillus-like species in the samples in the process of sugarrefinery filtering mud composting fermentation

3 讨论

近年来，糖厂滤泥用于生产生物有机肥成为资源化趋势。刘忠等[27]进行蔗田土壤有机质平衡预测，为甘蔗生产中合理使用甘蔗残体、糖厂滤泥和酒精废液，提高土壤肥力及甘蔗产量提供依据。蒙炎成等[28]研究了糖厂滤泥对蔗田土壤微生物数量的影响，结果表明处理后1个月，滤泥和酒精发酵液处理土壤细菌总数均达到最大值；处理后2个月，滤泥处理土壤放线菌总数达到最大值；处理后3个月，土壤丝状真菌总数达到最大值；说明糖厂滤泥对提高蔗田土壤微生物数量有显著的促进作用。谢少兰[29]报道了利用糖厂滤泥挤压造粒生产有机无机复混肥的工艺技术，产品的农田试验获得较好效果，利用滤泥和蔗灰作为有机质，掺合适量的氮、磷、钾，制成滤泥（蔗灰）复混肥料，农田试验证明，对农作物有增产效果，已被当地的蔗农所认识。然而，糖厂滤泥料堆肥发酵生产微生物肥过程芽孢杆菌种群变化动态的研究未见报道。

表3 糖厂滤泥堆肥发酵堆场周围土壤土芽孢杆菌种类分离鉴定Table 3 Isolation and identification of the Bacillus-like species in the soil samples around the sugar-refinery filtering mud composting fermentation yard

糖厂滤泥堆肥发酵生产生物有机肥过程中芽孢杆菌种类比较丰富。本研究分离到7属27种芽孢杆菌，在这些芽孢杆菌中，发现6种国内未见报道的芽孢杆菌，它们是：（1）Bacillus glycinifermentans FJAT-47935、FJAT-47944、FJAT-47907（大豆发酵芽孢杆菌），由韩国学者Kim等[30]从大豆发酵物中分离的芽孢杆菌新种；（2）Bacillus hisashii FJAT-47926（外村尚芽孢杆菌），由日本学者Nishida等[31]从取食高温堆肥发酵物的无菌老鼠的盲肠中分离的芽孢杆菌新种；（3）Bhargavaea cecembensis FJAT-47948（科研中心哈格瓦氏菌），由印度学者Manorama等[32]从印度洋查戈斯-拉克代夫海岭深5904 m沉积物中分离的哈格瓦氏菌属新种，属于芽孢杆菌目、动球菌科；（4）Lysini⁃bacillus acetophenoni FJAT-47912、FJAT-47934、FJAT-47919（苯乙酮赖氨酸芽孢杆菌），由Azmatunni⁃sa等[33]从有机溶剂乙酰苯中分离的赖氨酸芽孢杆菌新种；（5）Ornithinibacillus bavariensis FJAT-47915（巴伐利亚鸟氨酸芽孢杆菌），由德国学者Mayr等[34]从德国巴伐利亚洲巴氏消毒牛奶中分离，建立鸟氨酸芽孢杆菌新属的模式种；（6）Ornithinibacillus scapharcae FJAT-47951（拾蛤鸟氨酸芽孢杆菌新），由韩国学者Shin等[35]从死蛤上分离出的鸟氨酸芽孢杆菌属新种；这些芽孢杆菌为我国芽孢杆菌新纪录种。

糖厂滤泥堆肥发酵过程芽孢杆菌种群动态的研究表明，糖厂滤泥堆肥发酵初期，自带丰富的芽孢杆菌种群，包括了8种芽孢杆菌，总含量达114万cfu·g-1，达到常规接菌的水平。经过30 d发酵，芽孢杆菌数量上升达到高峰，种类下降为6种，除了Bacillus si⁃amensis FJAT-47940与前一期发酵相同外，其余种类不同，种类变更率83%；含量与堆肥发酵初期比上升了107.89%，达237万cfu·g-1；经过60 d堆肥腐熟，芽孢杆菌数量大幅度下降，与前一期发酵相比，数量下降了84.13%，为37.6万cfu·g-1，虽然数量下降，但种类上升为10种，除了Oceanobacillus caeni FJAT-47952、Oceanobacillus polygoni FJAT-47947、Bacillus siamensis FJAT-47950相同外，其余种类不同，种类变更率70%，物料腐熟过程另外一批芽孢杆菌种群占优势；到了添加化肥阶段，添加化肥成分N∶P∶K=15%∶5%∶8%，添加化肥后，产品造粒加工过程工序在混合槽内存放1～2 d，此时，芽孢杆菌数量有所回升，总含量为152万cfu·g-1，种类有所下降，为8种，其中除了Oceanobacillus caeni FJAT-47911、Bacillus tequilensis FJAT-47913、Bacillus thermotolerans FJAT-47914以外，其余种类不同，种类变更率达62%；进入圆盘造粒阶段，混合物料经过圆盘造粒，烘干、包装等工序生产出产品，此时，芽孢杆菌数量大幅度下降，总含量为43万cfu·g-1，种类为8种，除了Bacillus thermotolerans FJAT-47921、Lysinibacillus endophyticus FJAT-47919、Bacillus tequilensis FJAT-47925外，其余种类不同，种类变更率为62%。

作者首次揭示了糖厂滤泥堆肥发酵、生物有机肥加工过程芽孢杆菌种群结构发生较大变化；糖厂滤泥堆肥发酵全过程不外加芽孢杆菌接种剂，自带的芽孢杆菌能发挥作用，数量变化范围在-80%～+100%；种类的变更率在62%～84%，即不同堆肥加工阶段芽孢杆菌种类大部分不相同，尽管堆肥发酵过程有些阶段芽孢杆菌含量较高（如堆肥发酵中期芽孢杆菌数量达237万cfu·g-1），但在最终复合生物肥料产品中芽孢杆菌总含量仅为43万cfu·g-1。同时，这些芽孢杆菌与本地土壤芽孢杆菌关系不大，主要是由自身原料携带的种类；堆肥加工过程，那些适应堆肥物料变化的种类生长起来，不适应的被淘汰，不同芽孢杆菌通过对堆肥物料适应，其选择了相应的优势生态位。因而，在糖厂滤泥堆肥发酵时，自身的营养成分和生长条件（湿度、通气、pH、温度等）选择了自带的足够丰富的芽孢杆菌种群，外加芽孢杆菌菌种的必要性值得讨论。在生产复合生物肥料时，添加芽孢杆菌菌种进入产品，是否能提升产品的芽孢杆菌含量值得讨论，要看芽孢杆菌对物料适应性和加工过程的适应性，才能形成有效芽孢杆菌种群。

4 结论

糖厂滤泥堆肥发酵、添加加工过程芽孢杆菌种群结构发生较大变化，数量变化范围在-80%～+100%；种类的变更率在62%～84%。

糖厂滤泥堆肥发酵的芽孢杆菌主要来至自身携带的种类，本地土壤芽孢杆菌关系不大。尽管堆肥发酵过程有些阶段芽孢杆菌含量较高（如堆肥发酵中期芽孢杆菌数量达237万cfu·g-1），但在最终复合生物肥料产品中芽孢杆菌总含量仅为43万cfu·g-1。

糖厂滤泥堆肥发酵，分离到7属27种芽孢杆菌，在这些芽孢杆菌中，发现6种国内新纪种，它们是：（1）Bacillus glycinifermentans（大豆发酵芽孢杆菌），（2）Bacillus hisashii FJAT-47926（外村尚芽孢杆菌），（3）Bhargavaea cecembensis FJAT-47948（科研中心哈格瓦氏菌），（4）Lysinibacillus acetophenoni（苯乙酮赖氨酸芽孢杆菌），（5）Ornithinibacillus bavariensis（巴伐利亚鸟氨酸芽孢杆菌），（6）Ornithinibacillus scaphar⁃cae（拾蛤鸟氨酸芽孢杆菌新）。