基于离子液体-双水相体系同时测定蜂蜜中3种三嗪类除草剂残留

田宏哲，张明浩，周鑫杰，袁宝辉，张晨光

(沈阳农业大学 植物保护学院，辽宁 沈阳 110161)

三嗪类除草剂被广泛应用于防治田间杂草,提高农作物产量[1]。但该类除草剂的大量使用对生态系统和人类健康造成了极大危害[2-3]。因此，为保障农产品及环境安全[3-4]，亟需建立经济、快速、简单和灵敏的三嗪类除草剂残留的分析方法。为降低实际样品中基质和杂质对待测物质测定的影响，常需采用合适的样品处理方法。目前，三嗪类除草剂的萃取方法有液-液萃取法[5]、固相萃取或固相微萃取法[6-8]、分散液液微萃取法(DLLME)[9-10]、其它微萃取方法[11-13]和加速溶剂萃取法[14]，但液-液萃取法步骤繁琐，需使用大量有害和挥发性有机溶剂；加速溶剂萃取法在高温高压下采用有机溶剂进行样品萃取，对环境危害较大；其余萃取方法虽可降低有机溶剂用量，但存在重复性差和样品残留问题。

20世纪60年代Albertsson等[15]最先建立双水相萃取体系(ABS)，然而早期的双水相体系多采用两种聚合物[16]或聚合物与无机盐[17]形成，其原理是两种聚合物或聚合物与盐之间在一定浓度上由于排斥作用互不兼容从而形成两相体系。与传统的液-液萃取法相比，双水相体系具有低能耗、易于规模化及良好的环境兼容性等优势，但两相间有限的极性区间限制了其广泛应用。离子液体(IL)是由不同阳离子和阴离子形成的在室温或接近室温下呈液体状态的有机盐[18]，与传统的有机溶剂相比，离子液体具有不可燃性、电导率高、热稳定性和化学稳定性高、不易挥发等优势，作为“绿色”溶剂在农药残留萃取方面具有极大的潜力。

2003年Rogers等[19]首次采用咪唑类离子液体与磷酸钾建立双水相体系，随后引起了研究者的广泛关注。离子液体与无机盐[20-21]、聚合物[22- 23]、表面活性剂[24-25]等均可形成双水相体系，该体系具有粘度低和环境污染小等优点，已在有机污染物萃取领域有一定应用，但目前尚未对其在农药残留萃取方面进行深入研究[20,26-27]。

本文基于非离子表面活性剂曲拉通 x-100(Triton x-100，简写为Tr)，以及醋酸胆碱([Ch][Ac])、丙酸胆碱([Ch][Pro])、丁酸胆碱 ([Ch][But]) 等不同类型的离子液体和水形成的ABS差异，选择[Ch][Ac]和Tr建立ABS，比较了不同温度对该ABS相图的影响。确定了不同萃取条件对三嗪类除草剂分配系数的影响，明确了待测组分在该体系中的萃取行为,从而为采用双水相体系萃取该类除草剂残留提供了重要的理论依据及参考。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 高效液相色谱(美国Agilent公司)；RV10旋转蒸发仪、RT10磁力搅拌器(德国IKA公司)；XH-C涡流混合器(常州浪跃仪器制造有限公司)；DT5-1离心机(北京时代北利离心机公司)；Modulyo-D冷冻干燥仪(美国Labconco公司)；AVANEC-600核磁共振波谱仪(600 Ultra Shield，德国Bruker公司)；IRAffinnity-1S红外光谱仪(日本岛津公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯)，Tr (试剂级)，氢氧化胆碱(水中质量分数46%)，丙酸、冰醋酸及丁酸(纯度>99.5%)，西玛津、氰草津及阿特拉津(纯度≥ 98.0%)，上述试剂均购自Sigma-Aldrich公司。实验用水为“娃哈哈”纯净水(杭州娃哈哈集团)，其它试剂均为分析纯。蜂蜜样品购自当地超市，分别为1种枣花蜜，2种椴树蜜，2种槐花蜜。

采用甲醇制备各除草剂的标准储备液 (1.0 g/L)，以甲醇稀释制备100 mg/L的混合标准溶液，然后以甲醇逐级稀释制备标准工作溶液。

1.2 离子液体的合成及结构鉴定

通过酸碱中和反应制备离子液体：将有机酸(0.1 mol)的甲醇溶液加入250 mL圆底烧瓶中，然后将等物质的量的氢氧化胆碱水溶液加至相应的有机酸溶液中，混合物在室温(25 ℃)下连续搅拌12 h。所得混合溶液用旋转蒸发仪去除溶剂后，采用冷冻干燥仪真空干燥4～5 d去除水分。

采用核磁共振(NMR)波谱仪和红外光谱仪测定离子液体的化学结构及纯度，该类胆碱离子液体的红外光谱与氯化胆碱[28]的谱图相似，特征峰如下：3 145、3 025、2 850、1 573、1 386、1 080 cm-1。NMR数据参见文献[20,24]，测定结果证实了各离子液体的化学结构，同时根据积分面积比值确定各离子液体的纯度均大于95%。

1.3 双水相体系的制备

1.3.1相图绘制向含有已知浓度Tr的试管中滴加IL溶液，直至混合物变浑浊，然后加入水使混合物再次澄清。根据所有加入组分的质量计算各相组分的浓度。重复上述过程，获得足够的数据绘制ABS相图。

1.4 ABS萃取三嗪类除草剂

首先考察了不同萃取条件对待测组分分配系数的影响：向10.0 mL离心管中,依次加入Tr、IL、水和除草剂标准溶液,形成基于不同质量分数的Tr 和[Ch][Ac]的ABS体系。室温下将该混合溶液剧烈混合2 min,以 4 000 r/min离心10 min后,静置2 h。相分离后,记录两相的质量和体积。上相主要由[Ch][Ac]和水组成,下相主要由Tr、水和除草剂组成。将两相经0.45 μm 滤膜过滤后,依次采用HPLC法测定待测组分。以其在Tr相和IL相中的浓度之比为待测组分的分配系数(K)，计算公式为：K=CTr/CIL，式中，IL和Tr分别代表IL和Tr相,C为待测组分的浓度。

随后采用该ABS体系测定加标样品及实际样品。实际样品处理方法：称取10 g蜂蜜样品于100 mL离心管中，加入20 mL水，混匀，备用。加标样品制备：向空白样品中加入待测组分标准溶液，分别配制添加水平为0.02、0.05、0.2 mg/kg的加标样品。向离心管中依次加入Tr、IL、加标样品或实际样品，形成质量分数为3.80% Tr和35.05% IL的萃取体系，然后按上述步骤处理，采用HPLC法测定待测组分含量。同时按照上述萃取步骤，测定空白样品进行对照。

1.5 液相色谱条件

Zorbax Eclipse XDB C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Agilent公司)，柱温为30 ℃，流速为1 mL/min，进样量为20 μL，检测波长为220 nm。流动相：A为水，B为乙腈(ACN)，梯度洗脱程序：0～20 min，30%～50%B；20～25 min，50%～85%B；25～26 min,85%～95%B，保持4 min；回到初始状态，平衡5 min。

图1 不同离子液体对双水相体系相图的影响Fig.1 Effect of different ionic liquids on the phase diagram of ABSs

2 结果与讨论

2.1 基于胆碱离子液体的双水相体系相图

2.1.1离子液体对双水相体系的影响在室温下绘制由水、Tr和不同胆碱离子液体([Ch][Ac]、[Ch][Pro]和[Ch][But])组成的双水相体系的相图，考察了不同离子液体对双水相体系溶解度曲线的影响(图1)。图中溶解度曲线以下的区域为双相区，上方的区域为均相区。结果显示，不同离子液体组成的双水相体系的溶解度曲线呈现相似的变化趋势，而双水相体系的双相区面积大小顺序为：[Ch][Ac]>[Ch][Pro]>[Ch][But]，表明该类离子液体的相形成能力随离子液体阴离子的碳链长度增加而降低。这是由于盐析效应的影响，碳链较长的离子液体疏水性更强，与水的亲和力减弱，难以将表面活性剂盐析形成另一相。考虑到各离子液体的盐析能力，选择[Ch][Ac]与Tr构建ABS。

2.1.2温度对双水相体系的影响考察了不同温度(298.2、308.2、318.2 K)对Tr-[Ch][Ac]体系相行为的影响。由于双水相体系的形成为吸热过程，双相区面积随着温度的升高而增大，Tr和[Ch][Ac]形成双水相体系的能力增强。但不同温度对该体系双相区面积的影响并不显著，因此选择在室温下进行实验。

2.2 不同萃取条件的影响

西玛津、氰草津和阿特拉津的pKa值分别为1.62、0.63和1.70[29-30]，该类除草剂在强酸或强碱性溶液中易降解。而[Ch][Ac]-Tr体系中离子液体相(上相)和表面活性剂相(下相)的pH值分别为弱碱性和中性 (pH 6～8)，因此在该双水相体系提取过程中,待测组分较稳定。在萃取过程中，由于表面活性剂比离子液体的疏水性更强，待测组分通过疏水相互作用主要富集在表面活性剂相。这与待测组分的油/水分配系数(Ko/w)相一致，其中西玛津、氰草津和阿特拉津的Ko/w分别为2.18、2.22和2.61[31]。

研究表明[17]双水相体系中两相组分的含量显著影响目标组分的分配系数(K)，由于在双水相体系中不同系线长度可以反映两相组分的不同含量,所以系线长度(TLL)也会影响待测组分的分配系数。因此,本文研究了待测组分的K值与TLL之间的关系。

2.2.1离子液体质量分数对待测组分分配系数的影响以10%Tr与不同质量分数的[Ch][Ac](20%～40%)建立了5个ABS体系，对应的系线长度(以100TLL表示，100倍TLL)随着[Ch][Ac]质量分数的升高而增大。考察了不同系线长度下[Ch][Ac]质量分数对待测组分分配系数的影响(图2A)，结果表明，待测组分的K值随系线长度的增大而增加，即随[Ch][Ac]质量分数的升高而增大，进一步证实了盐析作用是该体系的相分离机理。

2.2.2表面活性剂质量分数对待测组分分配系数的影响以20%[Ch][Ac]和不同质量分数的Tr(10%～30%)建立了5个ABS体系，对应的系线长度随着Tr质量分数的升高而增大。考察了不同系线长度下Tr质量分数对待测组分分配系数的影响(图2B)，结果表明，待测除草剂的分配系数随系线长度的增大而降低，即随Tr质量分数的升高而降低。这是由于表面活性剂相的体积增大产生了稀释效应，使待测组分在该相的浓度降低。同时，表面活性剂相的粘度随着体系中表面活性剂质量分数的增加而增大，从而降低了萃取过程中待测组分在两相间的传质速度。因此，随着Tr质量分数的增大，待测除草剂在表面活性剂相的溶解度由于传质和稀释效应的影响而降低。

上述研究表明，在Tr-[Ch][Ac]双水相体系中，K值随着离子液体质量分数的增加而增大，而随着表面活性剂质量分数的增加而降低。因此，可通过降低Tr质量分数及提高[Ch][Ac]质量分数来提高待测组分的K值及萃取效率，但Tr的质量分数太低，表面活性剂相收集困难，而[Ch][Ac]达35%后待测组分的萃取效率趋于稳定，因此选择Tr和[Ch][Ac]的质量分数分别为3.80%和35.05%。

2.3 方法评价

2.3.1线性关系与定量下限在上述优化条件下，采用建立的方法测定0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 mg/L的混合标准溶液，以所得峰面积为横坐标，相应的质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线。3种待测组分在0.1～20.0 mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数(r2)不低于 0.992。以未检出待测化合物的市售蜂蜜样品为基质进行加标实验，以10倍信噪比(S/N=10)确定西玛津、氰草津及阿特拉津的定量下限分别为0.005、0.02、0.01 mg/kg，均小于目前欧盟对蜂蜜中待测除草剂的最大残留限量(西玛津和阿特拉津的最大残留限量分别为0.01、0.05 mg/kg，氰草津尚无蜂蜜中的最大残留限量)，因此本方法符合农药残留分析的要求。

2.3.2回收率与相对标准偏差以未检出待测化合物的市售蜂蜜样品为空白样品，通过加标实验对该萃取方法进行验证，加标浓度分别为0.02、0.05、0.2 mg/kg，每个加标水平平行实验5次，得到待测组分的平均回收率为75.0%～114%，相对标准偏差为5.2%～7.6%，本方法的准确度和精密度均满足残留分析的要求。

2.3.3基质与相组分的影响图3为采用该方法测定空白样品加标0.05 mg/kg的色谱图，结果表明，基质成分与相组分均不会干扰目标除草剂的分离和检测。因此，该双水相体系可应用于实际样品中待测组分的萃取分离。

2.4 实际样品分析

为评价该ABS体系在实际样品分析中的萃取性能，在上述优化条件下将该体系应用于5种市售蜂蜜样品的萃取分离。称取约12.0 g蜂蜜样品，分别加入0.76 g Tr和7.01 g[Ch][Ac]形成萃取体系(其质量分数分别为3.80%和35.05%)，按“1.4”条件进行样品处理。结果表明，所有待测样品中均未检出此3种除草剂。

3 结 论

本文建立了基于离子液体[Ch][Ac]和表面活性剂Tr的双水相体系萃取分离结合高效液相色谱测定蜂蜜中3种三嗪类除草剂残留的分析方法，待测组分的定量下限为0.005～0.02 mg/kg，加标回收率为75.0%～114%。与传统的样品处理方法相比,该方法操作简单、温和、环境友好,适于高通量的样品处理，在农药残留分析中具有较好的应用前景。