桂皮醛抗曲霉的敏感性及对烟曲霉细胞壁的影响

邓洁华 李继红 祁晓明 王刚生

(1.河北医科大学第二医院皮肤性病科，石家庄 050000；2.河北医科大学第二医院检验科，石家庄 050000；3.河北医科大学第二医院电镜室，石家庄 050000)

免疫力低下患者感染侵袭性肺烟曲霉菌，治疗棘手，预后差，死亡率高达80%～90%[1-2]。目前,治疗侵袭性深部真菌感染的药物主要作用的靶点为真菌细胞膜[3]，其毒副作用大，易产生耐药性，临床应用多年，病死率仍然居高不下，是医院住院患者死亡的重要因素之一，已引起医学界高度的重视。从资源丰富的中药中寻找有应用价值的抗深部真菌感染药物有重要意义[4-6]。

桂皮醛 (Cinnamaldehyde,CA)是天然植物肉桂中一种小分子烯醛类有机化合物,具有多种药理作用[7-8]及对多种致病性真菌有广谱抗菌作用[9-11]。但桂皮醛对烟曲霉菌作用的靶点机制报道较少，本研究采用桂皮醛与卡泊芬净比较，以氟康唑作对照，对曲霉菌进行了抗菌活性的实验及电镜下观察对烟曲霉菌后超微结构的变化，探讨桂皮醛的抗菌机制，旨在为其进一步药用开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

透射电子显微镜 (日本电子JEOL JEM-1200EX型)，超净工作台 (北京半导体一厂)，离心机 (美国雅培公司)；桂皮醛 (纯度98%以上)江西雪松药用油有限公司提供；卡泊芬净 (caspofungin acetate)默沙东公司提供；氟康唑，辉瑞制药有限公司提供。标准株 (ATCC3626)由中国科学院微生物所提供，临床株，烟曲霉菌、黄曲霉菌为河北医科大学第二医院真菌室保存菌株。

1.2 方法

药基的制备 采用试管药基法，先将桂皮醛、卡泊芬净、氟康唑分别溶于9%吐温80内，配制成10%的药物母液，然后将母液分别再溶于高压灭菌后的葡萄糖蛋白胨琼脂基 (4%葡萄糖、1%蛋白胨、2%琼脂)内，趁热 (60℃左右)充分混合，将药基倍比稀释成2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 1、0.039 1、0.019 5、0.009 8 mg/mL，氟康唑稀释成2.5～0.009 8 mg/mL的系列药物浓度，每个试管5 mL放置斜面。

菌种接种 挑取已转种活化的菌株，加入0.85%氯化钠溶液中，用血细胞计数板将菌悬液浓度调节为1×106CFU/mL。每个试管药基内接种100 μL菌悬液，每个浓度接种2管，同时用葡萄糖蛋白胨琼脂基作对照，置36℃恒温箱内，每日观察生长情况，并记录，96 h后判读结果。

MIC值的判读 将每管生长的情况与阳性及阴性对照管相比较，以最低药物浓度无培养物生长的药基管为MIC终点。

电镜标本制作 ①0.1%桂皮醛液基制备：取0.1 g桂皮醛加入到9 g吐温80中，溶解后逐渐加入到90 mL葡萄糖蛋白胨液基中。将烟曲霉菌接种于0.1%桂皮醛药基内，36℃震动培养24 h,离心取菌丝及孢子，再经生理盐水冲洗、离心后送电镜。②0.1%卡泊芬净液基制备：取0.1 g卡泊芬净加入到9 mL生理盐水，然后逐渐加入到90 mL葡萄糖蛋白胨液基中。将烟曲霉菌接种于0.1%卡泊芬净药基内，36℃震动培养24 h，离心取菌丝及孢子，再经生理盐水冲洗、离心后送电镜。③0.1%氟康唑液基制备：取0.1 g氟康唑加入到9 mL生理盐水，然后逐渐加入到90 mL葡萄糖蛋白胨液基中。将烟曲霉菌接种于0.1%氟康唑药基内，36℃震动培养24 h,离心取菌丝及孢子，再经生理盐水冲洗、离心后送电镜。生理盐水作对照。

透射电子显微镜观察 分别取经0.1%桂皮醛、卡泊芬净、氟康唑及生理盐水作用后的烟曲霉菌，用3%戊二醛及1%锇酸双重固定，按常规脱水，环氧树脂618包埋，电镜超薄切片，以铀铅双染色，于透射电子显微镜下观察。每组取10个样本同时送电镜。

2 结 果

2.1 桂皮醛与卡泊芬净对曲霉菌抗菌活性

桂皮醛、卡泊芬净对曲霉菌MIC对比实验结果显示，桂皮醛、卡泊芬净对临床株、标准株曲霉菌 (烟曲霉、黄曲霉)均有较强的抗菌活性，且桂皮醛优于卡泊芬净。对照组氟康唑对临床株、标准株曲霉菌 (烟曲霉、黄曲霉)均显示耐药，结果见表1。

2.2 电镜结果

桂皮醛、卡泊芬净、氟康唑、生理盐水作用烟曲霉菌24 h后，对烟曲霉菌细胞结构的影响，结果见表2。

表13种药物对曲霉菌MIC分布情况 (MIC·mg-1·mL-1)

Tab.1Distribution of MICs of three drugs againstAspergillus

类别烟曲霉菌临床株(n=20)黄曲霉菌临床株(n=20)标准株(n=10)桂皮醛0.024±0.0090.026±0.0070.026±0.006卡泊芬净0.039±0.0120.042±0.0150.038±0.015氟康唑耐药耐药耐药t4.4724.3232.349P<0.001<0.0010.030

表23种药物对曲霉菌细胞壁、细胞膜结构的影响

Tab.2Effects of three drugs on cell wall and cell membrane structure ofAspergillus

名称细胞壁影响数量χ2P细胞膜影响数量χ2P桂皮醛 (n=10)10∗40.000<0.0010--卡泊芬净 (n=10)10∗0氟康唑 (n=10)00生理盐水 (n=10)00

注：*.桂皮醛组和卡泊芬净组细胞壁影响数量明显高于其余两组

透射电镜显示，生理盐水对照组，烟曲霉菌呈丝状，中间有隔膜，细胞表面光滑整齐，胞壁板状结构层次清晰，胞膜、胞核及细胞器清晰完整 (见图1a)，孢子呈椭圆形，胞壁、胞膜、胞核及细胞器清晰完整 (见图1b)。0.1%桂皮醛组，孢子、菌丝形态不规则，胞壁外层溶解脱落变薄，细胞核、细胞器等内容物溶解消失，呈空泡状，但孢子、菌丝胞膜及隔膜完整无损 (见图1c～e)。0.1%卡泊芬净组，孢子、菌丝形态不规则，胞壁外层溶解脱落变薄，细胞核、细胞器等内容物溶解消失，呈空泡状，但孢子、菌丝的胞膜及隔膜完整无损 (见图1f～g)。0.1%氟康唑组，细胞形态、细胞壁、胞核、细胞器等内容物基本完整无损，但细胞膜有轻度的损伤 (见图1h～i)。

图1A.生理盐水对照 (菌丝);B.生理盐水对照 (孢子);C.桂皮醛作用后 (孢子);D.桂皮醛作用后 (菌丝);E.桂皮醛作用后 (孢子);F.卡泊芬净作用后 (菌丝);G.卡泊芬净作用后 (菌丝);H.氟康唑作用后 (孢子);I.氟康唑作用后 (孢子)

Fig.1A. Saline cotyol (Hyphae); B. Saline cotyol (Spore); C. After cinnamaldehyde (Spore); D. After cinnamaldehyde (Hyphae); E. After cinnamaldehyde (Spore); F. After caspofungin (Hyphae); G. After caspofungin (Hyphae); H. After fluconazole (Spore); I. After fluconazole (Spore)

3 讨 论

真菌细胞壁是真菌与动物及人细胞之间的主要差别之一，葡聚糖和几丁质是真菌细胞壁最主要成分，因此他们是抗真菌药物作用的理想靶点。通过特异性抑制真菌细胞壁的合成而达到抑制或杀灭真菌目的的抑制剂，选择性高，对人体的副作用小，已成为研究热点之一[12]。桂皮醛被确定为最活跃的抗微生物组分，其最低抑菌浓度 (MIC)测定使其成为一个强有力的天然抗菌剂[13]。在药理上有广泛的活性，能破坏真菌细胞壁结构和功能的完整性，其结构中的醛为亲水基，易被真菌表面的亲水基吸附，破坏其细胞壁的多糖结构而穿透细胞壁，影响细胞的生物合成、抑制生长繁殖[14-15]。卡泊芬净是一种以真菌细胞壁为靶点的多肽类抗真菌药，特异性抑制真菌细胞1,3-β-D-glucan合成酶，造成细胞壁中1,3-β-D-glucan含量减少，引起细胞壁结构破坏，导致菌体破裂、死亡[16-17]。卡泊芬净在药理上均有广泛的活性，能破坏真菌细胞壁结构和功能的完整性。为了进一步验证桂皮醛对真菌细胞壁的影响，本实验用卡泊芬净进行比较，以氟康唑作对照，研究结果显示：①桂皮醛、卡泊芬净对曲霉菌 (烟曲霉、黄曲霉)均有较强的抗菌活性。②桂皮醛、卡泊芬净直接作用在烟曲霉菌细胞壁，干扰细胞壁葡聚糖的合成，导致胞壁结构受损，溶解脱落，细胞内外的渗透压破坏、细胞器溶解，最终菌体破裂、死亡。显示，桂皮醛具有与卡泊芬净相同的作用机制，即药物靶向作用在真菌细胞壁的1,3-β-D-glucan合成酶。③桂皮醛、卡泊芬净不影响细胞膜，对宿主不易产生毒副作用。④氟康唑对曲霉菌 (烟曲霉、黄曲霉)耐药，电镜显示，对烟曲霉菌细胞壁、胞核、细胞器等无显著性影响，只对细胞膜有轻度损伤。

本研究进一步验证了桂皮醛的抗菌活性及谢小梅等[18]通过电镜和同位素标记发现桂皮醛作用于曲霉菌细胞壁后使其结构破坏，细胞内外物质交换受阻，影响了物质的吸收、生物大分子合成，从而抑制了真菌的生长繁殖的理论。

桂皮醛对曲霉菌 (烟曲霉、黄曲霉)均有很强的抗菌活性，药物靶向作用在曲霉菌细胞壁而不影响细胞膜，而卡泊芬净有较强的抗菌活性但对曲霉菌细胞膜有一定的影响，对宿主产生一定的毒副作用。因此，桂皮醛将来有可能成为一种单向靶位抗曲霉菌的理想药物，对人类不易产生毒副作用，具有较好的安全性。