艾灸对胃荷瘤大鼠瘤体增长的抑制作用＊

谭 静，阳仁达，赵 欢，彭卓隽，欧阳里知，林亚平

（湖南中医药大学针灸推拿学院 长沙 410208）

胃癌（gastric carcinoma）是指源于胃粘膜上皮细胞的恶性肿瘤，常以上腹部不适、疼痛、呕吐等为主要症状。据国际癌症研究机构最新统计，胃癌的发病率、死亡率分别位于恶性肿瘤的第5 位、第3 位，70%以上的新发病例集中在中国在内的发展中国家[1]。因此，胃癌的防治工作仍然是我国亟待解决的公共卫生问题。目前胃癌的治疗已形成手术、放化疗为主，免疫治疗、热疗为辅的治疗模式。近年来，随着科学技术的发展，传统医学的科学内涵不断被揭示。艾灸作为中医学的重要组成，通过综合热效应激活体内经络系统诱导各种复杂的反馈响应，实现对疾病的防治，素有“保命之法，灼艾第一”的美誉。研究表明，艾灸已积极运用于各类恶性肿瘤患者生存质量的控制管理中[2-4]。我们的前期研究表明[5]：艾灸后，胃荷瘤大鼠外周血中的自然杀伤细胞、自然杀伤性T 细胞均被激活。但艾灸对瘤体生长的抑制作用尚不明确，为此，进行了以下探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级SD 大鼠6 只，雄性，160-180 g，用于瘤组织制备；SPF 级SD 大鼠50 只，雌雄各半，200-240 g，用于分组实验。上述动物购自中国食品药品检定研究院动物中心，动物生产许可证号为SCXK（京）2014-0013，动物使用许可证号为SYXK（京）2014-0003。实验在中国医学科学院肿瘤医院动物SPF级动物实验中心完成。饲养环境为12 h 昼夜节律交替，室温25 ±5℃，相对湿度50%-70%，适应性饲养1 周。整个实验过程中对动物的处理均遵照、符合有关的伦理学规定。

1.2 主要试剂及仪器

Walker-256 细胞（中国医学科学院肿瘤医院馈赠）；PCNA 抗体（美国BOSTER）；TUNEL 试剂盒（江苏凯基）；直径0.7 cm 艾条（长沙艾医生物）；戊巴比妥钠（上海化学试剂厂）；6002B型红外线治疗仪（徐州天飞有限公司）；数显表面测温仪（浙江波仕欧）；数显游标卡尺（500-151-30，日本三丰）；切片机（RM2016，上海徕卡）；摊片机（KD-P，浙江科迪）；脱水机（JJ-12J，武汉俊杰）；包埋机（JB-P5，武汉俊杰）；鼓风干燥箱（DHG-9053A，上海一恒）；电热恒温培养箱（DHP-9162，上海一恒）；显微镜（DM500，德国Leica）。

1.3 模型建立方法

参考文献[6,7]，模型建立主要包括腹水瘤制备、皮下瘤组织制备、手术移植三个过程。腹水瘤制备：将3只体重160-180 g 大鼠分别腹腔注射0.3 mL Walker-256细胞的悬液（2×107个·mL-1）。皮下实体瘤组织制备：腹腔注射7 d 后，待明显腹水时处死动物，收集腹水中Walker-256 细胞，调整至0.5 × 107个·mL-1，皮下注射于3 只160-180 g 的大鼠右前、右后肢，每个部位0.2 mL。手术移植：皮下注射7 d 后，待注射处形成大小约1.5 × 1.5 × 1 cm3的皮下实体瘤后，处死动物，切开瘤体，取大小约0.8 × 0.8 × 0.5 cm3新鲜鱼肉样瘤组织通过手术移植于体质量200-240 g 大鼠胃大弯皮区、腺区交界处的胃壁上。7 d后剖腹探查判断造模是否成功。模型成功标准：原种移植处形成体积0.5 cm3以上的瘤体，表面光滑，边界清晰，无粘连及脏器侵犯，组织学证实与皮下实体瘤同源（图1）。

图1 皮下实体瘤（左）、胃部瘤体（右）HE染色观察（×400倍）

1.4 实验分组及治疗

分组方法：实验分为空白组、假手术组、模型组、艾灸组及红外组5 组。采用随机数字表进行随机编号。手术模拟皮下实体瘤组织胃壁移植过程，成功后，随机分入假手术组；通过1.3 中所述方法制备胃荷瘤动物模型，成功后，随机分入模型组、艾灸组及红外组。每组动物10只，雌雄各半，共计50只动物。

治疗方法：造模成功的第2 d，艾灸组参考《实验针灸学》[8]中有关大鼠穴位定位方法，仰卧位固定施灸中脘、关元、足三里（双），隔日俯卧位固定施灸脾俞（双）、胃俞（双）。施灸时，将直径为7 mm 艾条固定在自制艾灸架上于穴位垂直上方点燃。利用表面测温仪实时监测表皮温度，适时去除艾灰、调整施灸高度，确保表皮温度持续在42±1℃之间。每次施灸20 min，1 日1 次，连续21 d。红外组于造模成功后第2 d，使用波长0.4-3 μm.的短波红外线照射，强度1 档、输出功率10W、光斑直径3 cm，隔日交替照射胃脘部及背部T11 至T13 区域，治疗时温度的控制及要求、治疗时间、频次、疗程同艾灸组。空白、假手术、模型组动物在同一时间段，隔日仰卧、俯卧交替捆绑束缚。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 生存状态积分评定

正常大鼠，活动自如，毛色光亮（5 分）；呼吸平稳，对外界刺激反应较敏锐，能站立行走，但步态较缓慢，毛色较光亮（4 分）；意识清醒，但不能四肢站立行走，可自主爬行，部分鼠毛脱落，毛质较粗糙、发黄（3分）；嗜睡，反应迟钝、呼吸较急促、浅快，呼吸动度可，较多鼠毛脱落，毛质较粗糙、背毛耸立明显（2分）；昏迷、静卧不动，只有微弱的腹式呼吸运动（浅慢），或明显节律紊乱、对外界刺激无明显反应，或极度迟钝、被毛耸立（1分）；死亡（0分）。

1.5.2 肿瘤生长抑制率

动物处死后，无菌环境下剖开腹腔，手术线结扎大鼠幽门部和贲门部，在两结扎线之间剪下全胃，PBS溶液轻柔冲洗，无菌纱布吸干多余水分后将胃平摊于定型滤纸，暴露肿瘤部位，用电子游标卡尺测量胃部瘤体的最长径（a），最小径（b），根据公式V =（π/6）×[（a+b）/2]³，计算出肿瘤的体积。另可根据以下公式，计算肿瘤生长抑制率。

1.5.3 肿瘤组织形态学观察

取肿瘤组织，4%低聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片。苏木精-伊红（HE）染色，普通光镜下观察肿瘤组织坏死，血管等情况。

1.5.4 免疫组化法检测PCNA的表达

具体操作严格按试剂盒说明的要求进行，石蜡切片用微波修复抗原。PCNA 一抗稀释度1∶50，DAB 显色，苏木精复染。PCNA 阳性细胞胞核呈棕黄色。采用北航医学图像分析系统于400倍镜下采集各组肿瘤组织内3个视野的图像，分析其阳性目标数密度。

1.5.5 TUNEL 法检测肿瘤细胞凋亡

按照试剂盒说明进行对标本的固定、封闭、阳性制片、连接、标记、显色、复染操作。制片后，在光学显微镜下观察拍照。凋亡细胞的阳性反应物质位于细胞核内,颜色为棕黄色。采用北航医学图像分析系统于400 倍镜下采集每个样本3 个视野的图像，分析记录阳性细胞数密度。

1.6 统计学处理方法

所有数据使用SPSS 20.0软件进行处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示。所有数据资料进行正态性检验和方差齐性检验。满足正态性时，多组间比较采用单因素方差分析，若方差齐时用LSD 法检验，不齐时用Dunnett T3 法检验。不满足正态性时，采用秩和检验。以P＜0.05定义差异有统计学意义。

图2 各组大鼠大鼠生存状态积分比较（）

图3 各组大鼠胃瘤体体积比较（±s）

2 结果

2.1 艾灸对荷瘤大鼠生存状态的影响

在观察时间内，各组均未见动物死亡。由图2 可知：与空白组比较，模型组成模后第5 d 起生存状态持续变差（P＜0.01）；干预15 d 后，与模型组比较，艾灸组、红外组动物生存状态改善，积分值增加（P＜0.01，P＜0.05），且艾灸组动物的状态优于红外组（P＜0.05）；干预20 d 后，艾灸组动物的生存状态积分与空白组比较已无差异（P＞0.05）。

2.2 艾灸对荷瘤大鼠肿瘤体积及转移的影响

干预期间内无动物死亡。干预结束处死动物、开腹探查后发现模型组、艾灸组、红外组均有瘤体破溃消失，其中模型组1只，艾灸组6只、红外组3只。如图3所示，剩余动物瘤体体积组间出现差异，表现为艾灸组、红外组瘤体体积明显小于模型组（P＜0.01，P＜0.05），但艾灸、红外组组间无差异（P＞0.05）。经计算，艾灸组、红外组的肿瘤生长抑制率分别为41.89%、28.09%。另外，各组均有肿瘤细胞转移，其中模型组4例，艾灸组1 例、红外组6 例，转移部位以腹水及脾脏最多（表1）。

表1 各组肿瘤细胞转移情况

2.3 艾灸对荷瘤大鼠瘤体形态学观察（HE）

如图4所示，模型组瘤体内出现大量增生的血管，血管壁较厚，较少有坏死灶；艾灸组瘤体内出现大量坏死灶，血管较少；红外组瘤体内尽管出现了一定量坏死灶，但也有大量血管增生，且血管壁较薄。

2.4 艾灸对荷瘤大鼠肿瘤细胞增殖的影响

如图5-图6 所示，模型组内肿瘤细胞PCNA 呈强阳性表达，艾灸组内呈弱阳性表达，红外组内呈较强阳性表达。与模型组比较，艾灸组、红外组阳性细胞数密度明显减少（P＜0.01，P＜0.05），其中，艾灸组比红外组减少更明显（P＜0.05）。

图4 各组肿瘤组织形态学×400倍

图5 PCNA法检测各组肿瘤细胞增殖×400倍

图6 PCNA法检测各组每平方毫米内阳性细胞数密度（±s）

图7 Tuenl法检测各组肿瘤细胞凋亡×400倍

图8 TUENL法检测各组每平方毫米内阳性细胞数密度（±s）

2.5 艾灸对荷瘤大鼠肿瘤细胞凋亡的影响

如图7-图8所示，Tunel法测定模型组瘤体内呈弱阳性表达，艾灸组内呈强阳性表达，红外组内呈较强阳性表达。与模型组比较，艾灸组、红外组阳性细胞数密度明显增加（P＜0.01，P＜0.05），其中，艾灸组比红外组增加更明显（P＜0.05）。

3 讨论

恶性肿瘤是威胁人类健康及社会经济发展的重大公共健康问题。尽管其诊断已相对成熟，但其治疗效果仍不理想，复发、病死率居高不下。手术、放化疗作为常规抗瘤方法，其弊端日益凸显：①非所有恶性肿瘤都符合手术指征；②放化疗带来副作用严重降低了患者的生存质量，削弱了治疗的依从性。由于肿瘤组织内血管丰富，较正常组织更易吸收能量而升温。研究表明[9-10]，肿瘤组织内温度升高至40℃以上后，细胞膜的流动性及通透性增加，酶失活、代谢抑制、DNA合成受阻，肿瘤细胞将程序化死亡；另外，升温将加剧血管内瘀阻，导致血管破裂、瘤体破溃；再者，热刺激介导热应激反应，促进热休克蛋白等物质合成释放，，促进抗体、抗原结合，阻止抗原抗体复合物脱落，激活T 淋巴细胞、巨噬细胞等，提高对肿瘤细胞的免疫杀伤[11,12]。基于此，临床多采用红外线、高频电磁波等对全身或局部加热以抗肿瘤。目前，热疗已成为临床第五大抗肿瘤疗法[13]。

艾灸作为中国传统疗法的重要组成，几千年来为保障民生健康做出了重要贡献。古人曾用“保命之法，灼艾第一”、“药之不及，针之不到，必须灸之”高度赞扬了艾灸对重症治疗的重要意义。中医认为，艾灸的温补、温通作用能有效针对肿瘤的“虚”、“寒”、“痰”、“瘀”、“毒”进行治疗。目前，艾灸已广泛应用于肿瘤患者各项症状的控制与管理当中，主要体现在减少放化疗的副作用，增加摄食及免疫力，调节情绪等方面[14-16]，对艾灸直接的肿瘤抑制作用观察较少。现代医学认为，艾灸主要通过灸热刺激，兴奋穴位中的感受器，其介导的复杂中枢响应，诱发对神经、内分泌、免疫等多个系统对综合调节。与单一的红外线照射治疗相比，艾灸释放出波长600 nm 左右的红光、2 500 nm 的中长波红外线等综合光线，穿透深度可达皮下1 cm 以上的深层组织，为机体的细胞代谢活动和免疫功能提供必要的能量[17-19]。由于艾灸时光线的谱形、强度、峰值在整个施治过程中都在一定范围内不断变化，很好地避免了温度感受器的耐受[17]。本实验中采用悬灸（温和灸）进行治疗，这是临床艾灸最常使用的施灸方法。施灸时，控制表皮温度在42℃左右，动物肛温在灸后8 min 时上升至40℃并稳定。这种温度既不会灼伤表皮，也能诱导热应激反应产生。施灸过程中，荷瘤动物确无明显的挣扎、撕叫等其他应激反应。

穴位的选择是确保艾灸疗效的关键因素之一。本研究中，通过详细研究胃癌发生的病因病机，确定扶正固本、温通经络、散瘀消滞为主要治则，结合对现有胃癌临床治疗针灸选穴规律的数字挖掘，确定施灸穴位为脾俞、胃俞、中脘、关元、足三里。选穴局部取穴、远端取穴结合辩证取穴，局部以胃募穴——中脘以理气行滞，健脾和胃，提高荷瘤部位温度；远端以胃之下合穴——足三里健脾益气、祛湿化痰，增强机体免疫力。选穴抓住“以虚为本”的主要病机，施灸关元以温肾阳、壮真火，补元气之根；施灸脾俞、胃俞补脏腑之气，调和阴阳之气机升降，促进纳运。前后穴位交替施灸保证了穴位对灸热刺激的敏感。实验过程中，我们发现造模后，荷瘤动物食量、体质量、活动量显著下降，大便稀，体现出中医“阳虚”、“气虚”之证。施灸后，瘤鼠上述异常得以改善。前期研究我们发现，艾灸能激活瘤鼠体内自然杀伤细胞、T 淋巴细胞，诱导大量热应激相关蛋白的表达，但对肿瘤的抑制作用没有详细观察。本研究结果证实艾灸能一定程度减少肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡，瘤组织坏死灶增加、血管生成减少，瘤体增长被抑制。这些提示艾灸或具有直接抗癌作用，但是否与前期研究有关，具体机制如何均具有待进一步研究。