中风病急性期痰热证与MMP-1和MMP-3表达的影响＊

郭春莉，付 强，高 颖

（1. 中国中医科学院西苑医院 北京 100091；2. 中国标准化研究院 北京 100191；3. 北京中医药大学东直门医院 北京 100700）

中风病是严重危害人类健康的常见病，具有高发病率、高致残率、高死亡率和高复发率的特点，已成为第一位致残和死亡的原因[1]。虽然超早期溶栓和急性期神经元保护取得了重要进展，但对于大多数脑缺血患者而言，神经元死亡不可避免[2]，患者多需要他人帮助才能完成日常生活活动，给社会和家庭带来沉重负担。基质金属蛋白酶（MMPs）是降解细胞外基质的蛋白酶类之一，在大脑的血管内皮细胞、星形细胞和小胶质细胞中都存在许多种类的MMPs，在出现脑缺血或者缺血的灌注损伤时，MMPs 被激活开始破坏基质和开放血脑屏障，导致脑水肿，促进急性脑梗死发病[3]。基质金属蛋白酶家族在人的动脉斑块损伤部位表达。激活的MMPs 降解纤维帽的结构基质组成，包括胶原纤维和弹力纤维，削弱纤维帽，成为斑块不稳定的主要因素。在外在触发条件下，斑块破裂，释放大量组织因子、激活血小板和凝血系统，形成血栓，导致脑血管疾病[4]。MMP-1是基质金属蛋白酶家族中表达量最高的间质胶原酶，动脉粥样硬化斑块脂质核心强烈表达MMP-1，局部血压增高，血流剪切力增强，可使血管壁合成MMP-1 增加，所以MMP-1 的表达与斑块破裂存在正相关，MMP-1 含量越高之处，斑块越易破裂[5]。Carrell 把动脉硬化损伤分成两类:①血管壁胶原数量增加致使血管腔变窄；②动脉瘤的出现使管腔体积变小，管腔发生破裂。目前研究表明，两种管壁损伤中都出现了MMP-1水平增高[6]，表明MMP-1 可能和动脉粥样硬化过程存在重要的关系。MMP-3 也是在动脉粥样斑块中表达的MMPs 家族的主要成员，它广泛存在于动脉粥样病变处，在斑块破裂中起重要作用，如果颈动脉B 超发现软斑块结合临床血浆MMP-3 升高，可进一步反应斑块的不稳定性，要积极地抗炎治疗，以预防及控制动脉粥样硬化的发生、发展，并预防和控制TIA进一步发展为脑梗死[7]。Henney等运用原位杂交技术检测到冠状动脉粥样硬化斑块中MMP-3 的转录物与巨噬细胞共同存在于斑块的肩部[8]。Silence Y 等[9]的研究也证实MMP-3 可通过降解基质成分而与斑块的不稳定性有关，从而认为，MMP-3 血清水平与颈动脉斑块稳定性有关，可能是反映动脉粥样硬化斑块不稳定性的新的指标。临床证据表明，中药对缺血性卒中治疗有效，其主要是通过干预证候达到改善或治疗疾病，临床研究提示，中风急性期约有40%-50%的病人表现出痰热证，中医药对中风病急性期痰热证的治疗也突显优势，之前的研究显示MMP-2 与中风病急性期痰热证存在相关性，可以成为微观辨证的依据，MMP-1 和MMP-3 亚型与脑梗塞的分型目前有一些相关性研究，MMP-1 和MMP-3与中风病急性期痰热证是否存在相关性，其相关性研究能否形成微观辨证的依据，以及能否成为证候诊断及疗效评价的依据对中医药治疗中风病具有重要的意义，目前未发现相关报道。

1 研究资料和方法

1.1 临床资料

本研究数据来源于2013 年8 月-2015 年5 月发病7 天内就诊于中国中医科学院西苑医院的缺血性中风痰热证患者45 名，非痰热证44 名，发病年龄均为35-85岁。

1.2 筛选中风病急性期受试者

1.2.1 疾病诊断

疾病诊断标准参照2005年卫生部疾病控制司、中华医学会神经病学分会颁布的《中国脑血管病防治指南（试行版）》的脑梗塞诊断部分。

1.2.2 证候诊断

证候诊断标准参照973 计划“缺血性中风病证结合的诊断标准与疗效评价体系研究”课题组制定的《缺血性中风证候要素诊断量表》。

1.2.3 纳入标准

符合疾病诊断标准；起病7 天以内；年龄≥35 岁且≤85岁者。

1.2.4 排除标准

蛛网膜下腔出血者；既往有肿瘤、造血系统疾病者；有精神性疾病患者；不配合者。

1.3 临床信息采集

所有入选受试者均填写统一表格，表格内容主要是人口学资料、病史调查，中风病急性期受试者并填写病例观察表、中风病证候要素诊断量表，分为痰热组和非痰热组，均于入院后第1 d 清晨空腹取血，采用酶联免疫吸附法测定血清MMP1和MMP-3水平。

1.4 研究方法

1.4.1 证候量化评定

经过统一组织的量表使用培训后，由纳入之日由脑病科医师使用《缺血性中风证候要素诊断量表》，对每例患者分别作出内风证、内火证、痰湿证、血瘀证、气虚证和阴虚证的量化诊断（得分≥10分诊断成立）。

1.4.2 受试者血清MMP1和MMP3的测定

在缺血性中风病起病第7 d 采肘静脉血10 mL，留取标本后尽快注入EDTA 抗凝管内，4℃、3000 r·min-1离心10 min，吸取上清液，-20℃至-80℃保存待测。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清中MMP1 和MMP-3的含量（ng·mL-1）。

1.5 实施过程及结果

1.5.1 试验仪器

酶标仪：芬兰（LabsystemsMultiskan MS），仪器型号：352 型；洗板机：（芬兰）Thermo Labsystems，仪器型号：AC8；离心机：微量高速离心机（国产），仪器型号：TG16W；培养箱：隔水式恒温培养箱（国产），仪器型号：GNP-9080型。

1.5.2 操作步骤

标准品的稀释与加样：标准品按照说明书稀释好五个梯度，各个梯度每孔加样量都为50 μl，

加样：分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μl，然后再加待测样品10 μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

温育：用封板膜封板后置37℃温育30 min。

配液洗涤：将30（48T 的20 倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T 的20 倍）倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5次，拍干。

加酶：每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外。

温育：用封板膜封板后置37℃温育30 min。

洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次，拍干。

显色：每孔先加入显色剂A50 μl，再加入显色剂B50 μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min.

终止：每孔加终止液50 μl，终止反应

测定：以空白空调零，450 nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后15 min 以内进行。（主波长450，辅助波长630）

1.5.3 计算

以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

1.6 统计学方法

应用SPSS 17.0版本，组内数据分析采取独立样本t检验，组间分析采取单向方差分析的方法.

表1 痰热组和非痰热组MMP1（ng·mL-1）含量测定参数

表2 痰热组和非痰热组MMP3（ng·mL-1）含量测定参数

2 研究结果

研究结果如下图所示：

研究共纳入缺血性中风患者89名，研究人员经过统一组织的量表使用培训后，由脑病科医师使用《缺血性中风证候要素诊断量表》，对每例患者分别作出内风证、内火证、痰湿证、血瘀证、气虚证和阴虚证的量化诊断（得分≥10 分诊断成立）。痰热证患者45名，非痰热证44名，所有入选受试者均填写统一表格，表格内容主要是人口学资料（指调查患者的个人信息，包括患者姓名、性别、出生日期、家庭住址、联系电话等）、病史调查（既往史、家族史、过敏史、生命体征、一般内科情况、神经系统检查等），中风病急性期受试者并填写病例观察表、中风病证候要素诊断量表。结果显示，发病7天内中风病痰热组MMP-1和MMP-3的表达较非痰热组比较，P＞0.05，统计学无明显差异。

3 讨论

中药对缺血性卒中治疗有效，其主要是通过干预证候达到改善或治疗疾病，因此证候的规范化研究一直是中风病诊疗研究的重点和难点。

“辨证论治”被认为是中医学术思想的精髓，已经成为指导中医临床诊断和治疗的基础。“辨证”就是对病人四诊所收集的临床信息进行概括、判断为某种证候，是论治的前提和依据，“论治”是根据辨的证候来确定治法和处方谴药，因此“证候”是连接中医学理论和临床研究的核心与关键问题。传统中医只能依靠望、闻、问、切来获取患者的临床信息等病情资料，临床信息分辨率低、信息量小，模糊性大，信息收集过程中主观性很大，而且受到个人师承、临床经验、认知水平和方法及不同时代的不同，导致辨出的证候差别很大，使得辨证的精确性和重复性较差，影响了研究结论的真实性和可靠性，而且证候的概念模糊不清，表现出对证候名称及其内涵描述的经验化和随意性。所以，目前的中医证候描述存在不确定性、中医病名描述缺乏规范性，随意性较大，缺乏统一的标准，不利于中医、西医理论的渗透和沟通，不利于自身的学术交流与对外交流，急需对证候规范化提出新的要求。

宏观辨证是指以中医基础理论为指导，根据四诊所取得的信息，判断出因、位、病、势的辨证方法。微观辨证是运用现代科技方法对中医证候内在的病理、生化等方面的客观指标进行分析，目的是深入探讨证候的内在机理，揭示其发生的物质基础，从而用客观指标补充中医病证诊断标准。宏观辨证客观化，微观指标整体化，宏观辨证与微观辨证有机地结合有利于证候诊断与评价的客观化，有利于中西医结合工作的推动。

王永炎院士对于证候的生物学基础研究方面，提出了重要的“证候概念及其属性”理论[10]：即证候是一个非线性的“内实外虚”、“动态时空”和“多维界面”的复杂系统，所谓“实”是指最能反映证候病机的权重最大的关键内容，是群体在某一特定病变过程中所具有的共性症状信息，是治则干预的依据。“虚”是指某一患者所表现的一系列个性化症状信息，对干预原则和方法具有一定影响作用。其中“内实外虚”是证候最重要的特性，这对于证候的基础研究有着重要的指导意义。基于证候概念的新诠释，生物学指标与中医证候是否相关，或者说中医证候微观指标的研究成为了难点、热点。证候与生物学指标的相关性研究也取得了丰硕成果，主要表现在以下方面：①筛查某一证候可能发生变化的指标；②某一疾病的西医诊断指标和其中医证型之间相关性的研究；③不同疾病同一证候微观指标异同的研究；④证候主要症状特征的现代医学阐释[11]。例如近些年对血瘀证的研究报道较多，在实验研究中发现了许多与血瘀证相关的指标，并将微循环障碍、血流变异常、血液凝固性增高或纤溶活性降低等6 项指标补充到了血瘀证的诊断标准中[12]。危氏等[13]通过对多种疾病的证候与实验室指标相关性的分析，临床观察了慢性胃炎和溃疡病患者102例，脾胃虚弱证组与脾胃湿热证相比，脾胃湿热证的幽门弯曲杆菌阳性率明显高于脾胃虚弱证，说明幽门弯曲杆菌感染与中医证候有一定相关性。

以高颖教授牵头的国家科技重大专项“重大新药创制”课题组（No.2009ZX09502-028），国家重点基础研究发展计划（973 计划）课题组（No.2003CB517102）既往动态采集175 例急性缺血性中风病患者四诊信息，并判断其证候要素，应用数据挖掘手段探讨缺血性中风急性期证候与生物学指标的关系，发现HSP70、ICAM-1、MMP9 可能是缺血性中风急性期血瘀证的微观指标，HSP70 可能为气虚证的微观指标。以上研究结果均为本课题的实施提供研究基础。

临床研究提示，中风急性期约有40%-50%的病人表现出痰热证，痰为气血津液代谢紊乱的产物，为有形之邪，具有黏稠重浊之性，易与火热相结，二者交结难解，不易变化。便秘便干、舌苔黄腻、脉弦滑构成中风病急性期痰热证的基本证候特征及辨证要点[14]。王永炎院士指出中风病急性期病机错综复杂，证候变化多端，病势发展迅猛，难以驾驭，且变证坏证频见，极易产生神昏、窍闭、厥脱等，为难治重证，提出了“毒损脑络”中风病机理论的观点。中医药对中风病急性期痰热证的治疗也突显优势。

大量临床实践证明痰热证是中风病急性期的常见证候，痰热证的证候演变特点及其与神经功能缺损程度密切相关，中医药主要是通过干预中风病痰热证证候因素以改善症状或治疗疾病。本研究结合前期研究的基础上，以王永炎院士提出的“证候概念及其属性”理论为依据，以痰热证与基质金属蛋白酶相关亚型的关系为切入点，发现中风病急性期痰热证的MMP-1 和MMP-3 的表达较非痰热组无明显差异，其原因解释为：①虽然此次试验的结果为阴性，但是可能因受试者基础疾病比较复杂，比如高血压、糖尿病、高脂血症、高同型半胱氨酸血症以及吸烟、饮酒等生活习惯均可能影响MMP1、和MMP3，可以通过扩大样本量，避免其它诸多因素对试验结果的干扰，来发现更为可靠的试验结果；②虽然本次研究显示中风病急性期痰热证与MMP1、MMP3 无明显相关性，试验结果为阴性，但中风病急性期的痰热证预后差，病情凶险确实与基质金属蛋白酶的某些亚型可能存在相关性，今后的试验可以通过多检测基质金属蛋白酶亚型来确定中风病急性期与基质金属蛋白酶表达的相关性，进一步对中风病痰热证证候诊断及疗效评价提供更加客观支持。