“谱效整合指纹图谱技术”在中药物质基础方面的研究进展及思考＊

朱 岩，戚 进，余伯阳

（中国药科大学中药学院 南京 211198）

中药是上千年来我国民族医药发展的集中体现，也是现阶段我国医药体系中的重要组成部分。传统中药在疾病治疗方面特色显著、疗效明确，但现代中药需要在传统的基础上发展与革新，以适应现代社会生产力进步的需要。在现代中药研发过程中涉及到多方面的研究，其中中药物质基础是影响中药发展与创新的核心问题。

目前，中药药效物质基础在中药研究中的重要性已被国内外所广泛认同，中药物质基础的阐明对于中药作用机制的深入、中药质量控制的制订、中药新药研发的来源、以及中药产品加工和生产过程中的指导等都具有极为深远的意义。中药药效物质基础研究主要包括中药药效物质的辨识、遴选和分离等方面，其中中药药效物质的辨识既是中药药效物质基础研究的重点也是其研究的难点。由于中药本身具有生物多效性和成分复杂性的特点，采用传统的研究方法从丰富的次生代谢产物环境中辨识出药效物质需要耗费大量的人力、物力和时间，因此必须引入一些新的技术方法以解决现有中药药效物质基础研究中存在的问题，提高相应的研究效率。在最近20年的中药物质基础研究方法中，“谱效相关”研究逐渐显示出在中药药效物质基础辨识方面的潜力。

1 中药“谱效相关”研究现状与发展

“谱效相关”研究源于对中药质量控制的研究，其中“谱”主要指采用各种光谱学和色谱学技术建立的中药指纹图谱。最初“谱效相关”研究的提出主要是为解决中药指纹图谱不能完全实现质量与药效的关联性，因而引入“效”的因素对其加以补充和完善，以期获得更为合理的质控方案。但在“谱效相关”研究不断深入的过程中，该方面研究体现出了在生物学与化学信息关联分析方面的优势，进而为解决中药药效物质基础辨识问题开启了新的思路。目前“谱效相关”研究已基本形成了相关研究的主体模式，主要是以高效液相或气相为主建立相关中药的指纹图谱，选择一个或多个体内或体外药效学指标对多批次中药的活性进行评价，采用灰色关联度分析、人工神经网络和回归分析等方法建立色谱峰与药效指标间的联系，实现“谱”与“效”的关联。相关研究已有大量报道，为中药药效物质基础研究提供了可资借鉴的技术方法和科学数据。但与此同时，越来越多的学者也指出，尽管当前“谱效相关”研究已取得较大进展，但其还存在不少有待商榷的问题。譬如，当前大部分“谱效相关”研究中只是基于数学方法计算获得的色谱峰与药效的关联系数，并不能获得各色谱峰的药效数据，对于数据结果的准确性和进一步分析的可能存在一定的限制。其次，当前处理谱效关联的各种数学方法均存在着不同的优势和缺陷，尚未出现一种被广泛认可的数学方法处理模式。此外，目前关于“效”的指标选择存在着过于笼统、无针对性的问题，缺乏对药效整体性评价的设计，关于多指标相关“效”的拟合方法，基本处于无研究或较为随意处置的状态。这些问题的解决还需要中药物质基础方面的研究者进行更深入的探索。

本课题组在2003 年前后提出了“生物活性指纹”这一概念，在此基础上于2010 年正式提出了“谱效整合指纹图谱”这一谱效学研究模式的基本研究思路和方法。该研究拟通过构建离线或在线的活性检测方法，获得所有指纹峰或峰群的活性数据，进而基于所获得的活性信息构建与中药化学成分指纹峰相对应的活性指纹谱，再经过统计分析或计算机处理，将不同的化学与生物学指纹信息整合后获得可直观反映中药药效物质基础的多信息图谱模式（图1）。基于该模式，本课题组在过去十多年的时间中，发展了多种离线或在线的活性检测方法，对山楂叶、银杏叶、淫羊藿、葛根、虎杖、金银花、玄参、绿茶、黄芩、何首乌等20多种中药/天然产物的物质基础和质量控制进行了研究，在此本文对相关研究成果进行简要总结，以期为基于“谱效相关”研究探索中药物质基础提供参考。

2 在线/离线活性检测方法的建立

抗氧化研究一直是中药研究中的热点问题，很多中药的疗效都与其对体内自由基代谢的调节有密切关系。因此本课题组选择从抗氧化的角度入手，进行离线或在线活性检测方法的构建。从分子层面来看，各种自由基及其活性衍生物、自由基来源的各种氧化酶、抗氧化的各种自由基相关清除酶构成了自由基代谢的基本主体。不同中药对其调节作用主要是通过直接清除自由基及其活性衍生物和对各种氧化酶和抗氧化酶的调节作用来实现的，因此需要根据指标的不同特性，分别设计相应的活性检测方法。

图1 “谱效整合指纹图谱”研究的主体模式

2.1 清除自由基及其活性衍生物的在线活性检测方法的建立

此外，DPPH 体系和ABTS 体系也是目前在抗氧化领域较为公认的检测方法，尽管DPPH 自由基和ABTS自由基并非体内内源性自由基，但其被广泛应用于对天然产物的活性评价。本课题组丁晓萍等[12]构建了清除DPPH 自由基在线活性检测方法，对银杏叶的抗氧化物质基础进行了分析；孙莉琼等[13]和张雷等[14]采用该方法，分别探讨了国产兔眼蓝莓和绿茶的抗氧化物质基础及相关质控方法；高翔等[15]构建了清除ABTS自由基在线活性检测方法，对消癌平注射液中的抗氧化成分进行了分析总结；王宇卿等[16]基于上述方法，对生脉散和益气复脉粉针抗氧化活性物质进行比较分析，明确了二者抗氧化物质基础的差异。

上述所建立的方法均为在线活性检测方法，在获得高效液相色谱图的同时即获得了与色谱峰一一对应的活性指纹谱，方法灵敏、快速且操作简便，为基于“谱效相关”探索中药物质基础提供了思路和方法学的借鉴。

2.2 基于调节酶活性的半在线/离线活性检测方法的建立

半在线/离线活性检测方法与在线活性检测方法相比，技术难度上要求相对简单，适用面也更为广泛。之所以采用半在线/离线模式，主要是基于两方面的考虑。尽管高效液相色谱的分离能力较为强大，但是中药复杂的次生代谢体系并不能确保每一个色谱峰均能实现基线分离，在此情况下，可采用对不同峰群进行划段收集的方式，进行活性检测后辨识其中主要的活性峰群。

本课题组刘荣华等[17-19]采用截峰收集的方法对山楂叶指纹图谱上的各指纹峰进行了收集，检测了不同浓度各指纹峰对中性粒呼吸爆发的抑制活性，基于不同浓度指纹峰峰面积和药效之间的关系建立了相应数学模型，并拟合出了相应的生物活性指纹，明确了山楂叶抑制中性粒细胞呼吸爆发的药效物质基础；牟玲丽和林以宁等[20,21]分别采用“缺失”峰策略制备了缺失特征性指纹峰和峰群的银杏叶和麦冬样品，比较了不同样品抑制中性粒细胞呼吸爆发的活性，预测了银杏叶和麦冬中主要的活性峰或峰群，并进一步采用人工神经网络（BP-ANN）方法建立了谱效相关的分析和预测模型。

另一方面，中药药效物质与酶作用反应的过程与清除自由基反应的过程不同，受反应环境的制约较多，此前本课题组所建立的在线活性检测方法大多为柱后反应检测活性，大部分酶类不耐有机试剂，洗脱液中的有机相容易引起蛋白变性，对细胞和酶类往往有一定损伤；其次，药效物质对酶作用一般需要一定的时间，因此对于基于酶活性的检测方法一般多采用离线的检测方法。常艳旭等[22]基于UHPLC/DAD/QTOF-MS 建立了金芪降糖片的指纹图谱，采用收集指纹峰的方法，对各指纹峰清除DPPH 自由基活性，抑制α-糖苷酶、α-淀粉酶、醛糖还原酶和脂肪酶的活性进行了研究，结果表明金芪降糖片药效物质基础中不同类型成分功能不同，酚酸类成分主要活性为清除自由基，生物碱和黄酮类成分均表现出对α-糖苷酶、α-淀粉酶、醛糖还原酶和脂肪酶的抑制活性，其中生物碱类物质活性较强；孙莉琼等[23]对柱后反应过程中黄嘌呤氧化酶活性受到的各种影响因素进行了考察，建立了收集流分后直接进行活性检测的半在线活性检测方法，该方法将在线检测O和半在线检测对黄嘌呤氧化酶抑制活性两种功能融为一体，并成功运用于中药黄芩和中药方剂黄连解毒汤的药效物质基础研究中。

超滤离心法是一种近年来在中药研究中逐渐兴起的新方法，方法简便快速且易于操作。某种程度上，该方法也可以认为是另一种离线的“活性检测”方法。超滤离心法的基本前提在于能与酶特异性结合的化学成分才是可能的药效成分，但其反映的是酶与化合物之间的特异性亲和作用而非药效结果，因此一般采用该方法后仍需进行药效验证。王莹等[24]采用超滤离心法建立了抑制髓过氧化物酶（MPO）活性检测方法，并结合之前所进行了分析，并采用了动物模型进行了活性验证，结果表明栀子中直接清除HOCl 的物质基础主要为环烯醚萜类和咖啡酰奎宁酸类成分，抑制MPO活性的物质则为栀子中西红花苷类成分。

固定化酶技术使酶的稳定性和重复使用性得到极大的提高，为酶在工业上的大规模运用提供了条件，载体作为固定化酶技术的重要组成部分，其结构及性能对固定化酶的催化活性及操作稳定性产生直接影响，已经成为固定化酶技术研究的热点。王婷等[25]通过对氨基、羧基及N-羟基琥珀酰亚胺三种功能团修饰的商业化磁珠固定化黄嘌呤氧化酶（XOD）效率进行比较，选择了最适合的氨基磁珠固定化XOD 进行表征和条件优化，建立固定化XOD 配体垂钓的方法，并应用于生姜、黄芩和葛根中，从生姜和黄芩中成功筛选并鉴定出12个潜在的XOD配体。

总体而言，在线方法更为简单、灵敏、快速，操作更为自动化，但其对指标的选取有一定受限条件；离线方法受指标选择的影响相对较小，相对选择范围较大，但其操作较为繁琐，两种方法需结合实际情况进行选择或结合使用。

3 数学方法的选择及输出模式

“谱效整合指纹图谱”采用的策略为直接获取各指纹峰或峰群的活性数据，其与化学成分的关联性更为紧密。但是所获得的活性数据多以抑制率的方式表征，难于体现对整体药效的贡献率，因此如何基于量化的方式准确评价各指纹峰对药效的贡献，仍然需要合理选择相应的数学方法。此外，评价每一个指纹峰的活性强弱需要量效关系的计算，考虑到获得所有指纹峰的对照品进行全成分定量的难度，需要合适的数学方法进行数据的转换。前期研究中本课题组提出了“效价”这一概念，通过建立阳性对照的量效关系方程，将不同指纹峰的活性代入该方程进行计算，获得各指纹峰效价值，并以阳性对照的单位药效作为效价单位，建立不同中药的效价指纹图谱。该图谱在一定程度上可直观显示各指纹峰对整体药效的贡献，并可用于不同批次中药的活性预测。

但是，中药具有生物多效性和成分复杂性的特点，其治疗某一种疾病的药效往往是多种活性体现出的复杂综合效应。这一综合效应既包括同一层面的活性也包括不同层面的活性。这种复杂的非线性模糊关系阻碍了对其药效的准确评估。在此背景下，本课题组首次提出了模糊数学结合层次分析法的方法用于同一层面活性的综合评价。

上世纪60年代中期，美国学者首次提出模糊数学的概念，标志着其的诞生。近几十年模糊数学发展异常迅速，已涉及到国民经济的各个领域，许多界限不分明甚至是很模糊的、不宜使用常规统计学的案例中，采用模糊数学都取得了较显著的成果。层次分析法是将决策有关的元素分解成目标、准则、方案等层次，在此基础之上进行定性和定量分析的决策方法。擅长于赋予不同指标合适的权重常数，常与模糊数学方法配合使用，通过建立相应的权重集，以便进一步的模糊数学计算。本课题组对茶叶和黄芩分别进行了谱效整合指纹图谱研究，建立了不同来源茶叶和黄芩在线清除H2O2，O和·OH 的活性指纹，采用层次分析法构建了对于清除H2O2，清除O和清除·OH 的权重集，并结合模糊数学运算，对茶叶和黄芩指纹图谱中各指纹峰综合抗氧化能力进行了评级，并根据评级结果选择综合抗氧化能力强的指纹峰，建立了相应的质控方法[8]。这一方法的优点在于，填补了目前国内谱效相关研究中效的拟合部分的空白。

在谱效相关研究中通过采用多种数学分析方法，其中主要包括：回归性分析、灰色关联度分析、人工神经网络等，把代表中药化学成分特征的“谱”和发挥药物活性的“效”有机的联系起来以实现中药谱效的最终关联。在谱效关联分析中，应根据实验对象的性质与要求，选择合适的方法，以期达到实验的最终目标。

回归分析（RA）是最常用的用于处理因变量和自变量之间关系的统计学方法之一。由于中药指纹图谱不只一个共有峰或特征峰，因此实际运用中多采用多元线性回归和多元非线性回归这两种方法探究中药“谱”与“效”之间的关系。而前者又较为常用，主要包含逐步回归法、强迫引入法、强迫剔除法、前向逐步法、后向逐步法[26]。严丹等[27]采用多元线性回归分析对槟榔提取物HPLC 指纹峰和其在体外促进肠平滑肌收缩的关系进行谱效研究，确定了槟榔促进十二指肠收缩的主要药效物质基础。张静等[28]采用多元回归分析和双变量相关分析探求红花不同提取物配伍当归-川芎药对超临界提取物（AC-SFE）的共有指纹峰相对峰面积与其抗心肌缺血作用的谱效关系，从AC-SFE中得到8 个可能的抗心肌缺血药效物质，该方法为复方配伍机制研究和药效物质基础发现提供了依据。余婧等[29]对广东紫珠指纹图谱数据和其止血作用结果采用逐步引入法回归分析，论证了苯乙醇苷类和黄酮类成分是广东紫珠发挥止血作用的有效成分。

偏最小二乘回归（PLSA）融合主成分分析、多元线性回归分析及典型相关分析的基本功能为一体，实现对数据信息充分挖掘，并具有预测精度较及模型易于解释等特点，是中药谱效相关研究工作中的一种有效方法[30,31]。刘淼等[32]采用UPLC-Q-TOF/MS 法建立黑玛咖8种提取物的指纹图谱，采用PLSA对指纹图谱的特征峰和其抗疲劳作用进行关联度分析，确定其主要药效成分，该方法为黑玛咖药效物质基础的深入研究和质量控制方法的建立提供思路。李昌勤等[33]基于ABTS、DPPH 和FRAP 法测定恒温加速法处理的女贞子抗氧化能力，对女贞子量化特征图谱和抗氧化活性数据分别进行PLSA 分析，成功筛选出其抗氧化相关色谱峰。张弦飞等[34]对枸杞子提取物大孔树脂水、30%、60%、90%乙醇洗脱部位抗氧化活性进行测定，测定60%洗脱部位抗氧化活性最好，基于此法采用UPLC-MS/MS 建立30 批次不同来源枸杞子指纹图谱，并结合其清除DPPH和ABTS活性的实验数据，研究其谱效关系，该方法的成功应用为枸杞子进一步开发和利用提供有力参考。

灰色关联度分析（GRA）是系统中多因素相互关联性的一类统计分析方法，参考与因素相关的样本数据对各因素间关系的强弱、大小和次序进行定量描述，若样本数据反映两者因素变化的大小、方向和速度等基本一致，则两间的关联度较大；反之，彼此关联度较小。杨冰月等[35]采用灰色关联度分析法对半夏及其炮制品总有机酸HPLC 指纹图谱与止咳的多个评价指标的关系进行分析，通过谱效关系阐明半夏及其炮制品发挥止咳作用的物质基础，为其质量控制与评价提供理论依据。林梦雅等[36]运用灰色关联度法建立丹参不同提取物的UPLC 图谱特征峰与其抗炎药效作用的谱效关系，最终确定4种主要药效成分，为成分的定量和药效评价提供指导，为丹参抗炎作用的药效物质基础提供思路。肖瑞瑶等[37]基于GC-MS 研究各种来源艳山姜挥发油化学成分，采用灰色关联度法建立成分指纹图谱与其抗炎镇痛活性间的谱效关系，该方法为艳山姜活性成分的发现提供了新颖思路，并为深入研究和建立其质量标准提供理论依据。池婕等[38]选择灰色关联度法分析雷公藤多苷片醋酸乙酯提取物指纹图谱与淋巴细胞增殖抑制药效数据的关系，实验表明雷公藤增值抑制药效作用是多成分共同起效的结果，为深入研究雷公藤药效物质基础及制定科学的质控评价标准提供参考。

人工神经网络（ANNs）是一种模仿动物大脑思维行为特征，进行分布式并行信息处理的算法数学模型。这种网络依靠高度复杂的系统，通过调整内部大量节点之间相互连接的关系，从而达到快速处理信息的目的，且具有自学习和自适应能力。李伟霞等[39]通过多指标综合指数法对当归川芎药对不同配比组方的3 种功效分别进行药效指标的标化和整合，采用人工神经网络对所测主要效应成分含量与其3种功效的整合效应分别进行拟合分析，阐释方药不同功效的效应物质基础及其对整方功效的贡献大小，为探究中药复方复杂效应物质基础提供新的方法与思路。尹永芹等[40]采用神经网络研究香丹注射液抗心肌缺血有效成分的谱效关系，确定其抗心肌缺血的主要成分并为其深入研究提供参考。许雯雯等[41]将气滞胃痛颗粒中6 味药材通过拉丁超立方法随机采样成不同比例组，进行体外抗炎活性研究，用灰色关联度对药效信息和各组HPLC 指纹图谱的化学信息进行相关性分析，得出与抗炎活性密切相关的化学成分，并运用BP 神经网络建立抗炎活性的预测模型，以便更好地评价气滞胃痛颗粒抗炎的真实药效。以上实验结果均表明人工神经网络在复方成分的药效学研究，具有一定的实用价值。

4 展望

中药“谱效整合指纹谱”这一谱效学研究模式是在“生物活性指纹”这一概念基础上提出的，是将中药化学鉴别与活性评价融为一体，能较为全面地反映中药复杂成分体系所各自对应的化学信息和生物活性信息，对中药质量控制和药效物质基础的新发现均具有极其重要的理论意义与指导意义。同时，该方法也是中医药学者在中药物质基础研究领域中的又一次深入探索和发现。但是，现存的各种研究方法都有其局限性，需要在日后的应用中不断地加以补充和完善。“谱效整合指纹谱”包括了对中药成分“谱”和药效活性“效”的整合，即通过采用多种活性评价方法或选取符合中药材临床作用特点的指标，注重多学科的交叉应用，实现“谱”与“效”的真正相关性，只有正确把握中药的整体性，才能充分发挥中药疗效。随着中药物质基础研究关联基础工作—药物分析、中药化学、药理学等的扩展与深入，现代分析技术和数据处理方法的快速发展与更新，中药谱效关系研究必将会在中药物质基础的辨识、遴选和分离等方面做出卓越贡献，进而推动祖国中医药事业的现代化和国际化。