隔药灸对克罗恩病大鼠结肠p38MAPK、ERK1/2及c-fos调节作用的研究＊

吴丽洁，李茜莹，杨延婷，杨 玲，施 征，赵粹英，吴焕淦，李志元，张 丹＊＊，马晓芃，＊＊

（1. 上海中医药大学岳阳临床医学院 上海 201203；2. 上海市针灸经络研究所 上海 200030；3. 浙江省中医院 杭州 310060）

克罗恩病（Crohn's Disease，CD）是一种原因不明的肠道炎症性疾病[1]，慢性起病，其主要临床表现为反复发作的腹泻、腹痛，可有血便、腹部包块、瘘管形成或肠梗阻，并伴有不同程度的体重减轻、发热、食欲不振、乏力、贫血等全身症状。严重者病程迁延难愈，预后不良，并可发生癌变[2]，严重影响患者的生活质量[3]。目前治疗CD 的原则是实现临床和内镜缓解，以避免疾病进展并最小化手术切除，达到维持缓解，黏膜治愈，提高患者生活质量的目的[3]。CD 的发病机制尚不十分明确，研究发现，CD 患者结肠中的磷酸化p38α、ERK1/2 水平明显增高，p38α选择性抑制药物可显著下调MAPK通路的激活和促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的分泌，提示p38MAPK、ERK1/2 与CD 发病关系密切[4,5]。本课题组前期研究发现艾灸可下调CD 结肠TNF-α、IL-1β等促炎细胞因子的表达，改善肠道炎症、促进黏膜损伤的修复[6-10]。在此基础上，本课题拟观察隔药灸对克罗恩大鼠结肠p38MAPK、ERK1/2 及cfos的影响，探讨隔药灸治疗克罗恩病的抗炎机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠36 只，体重（150 ± 20）g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK（沪）2013-0016，饲养于上海中医药大学实验动物中心。饲养条件：温度（20±1）°C，湿度50%左右，自由饮水、摄食。适应性饲养1 周，大鼠饮食、活动均正常后开始实验。本实验经上海中医药大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂

组织脱水机、包埋机、切片机、烤片机（莱卡公司，德国）；光学显微镜及senscell 分析软件（Olympus，日本）；转膜电泳仪、垂直电泳槽、凝胶成像系统（Bio-Rad,美国）；5%（w/v）2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）（Sigma，美国）；p38MAPK、c-fosELISA 试剂盒（源叶，中国）；BCA 蛋白浓度试剂盒、SYBR Green PCR 试剂盒（Thermo，美国）；逆转录试剂盒（Fermentas，加拿大）；Trizol（Invitrogen，美国）；Tris、TEMED（碧云天，中国）、SDSrunningbuffer（Bio-Rad,美 国）、ERK1/2（CST,美国）、GAPDH、二抗（博士德，中国）；苏木素染色液、伊红-染色液（南京建成，中国）；戊巴比妥钠、甲醇、异丙醇、无水乙醇、氯仿、二甲苯、中性树胶、甘氨酸（国药集团，中国）。

1.3 模型制备方法

参照国际公认的Morris 法[11]，应用TNBS 合50%乙醇溶液造模。造模开始前大鼠禁食、不禁水24 h，采用2%戊巴比妥钠（30 mg·kg-1）行腹腔注射麻醉。将无水乙醇加双蒸水配成50%乙醇，然后将5%（W/V）的TNBS 与50%乙醇按照体积比2∶1 混合制备TNBS 灌肠液。以TNBS 灌肠液3mL·kg-1（TNBS 用量为100 mg·kg-1）灌肠造模。灌肠针连接注射器，并抽取适当灌肠液，大鼠体位为头下尾上，灌肠时将灌肠针缓缓插入大鼠肛门6-8 cm，注入灌肠液，拔出灌肠针后再将大鼠倒立1 min，以防药液溢出。每7 d 大鼠重复灌肠1次，共灌肠4 次。造模结束后，每组随机抽取1 只大鼠，取结肠组织进行苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色光镜下观察，以鉴定模型制备是否成功。在确定模型制备成功的基础上开始干预治疗。

1.4 分组与治疗

SD 大鼠随机分为正常组、模型组、隔药灸组和假灸组，每组9 只。隔药灸组，选取天枢穴（双侧）、气海穴进行隔药灸，每次每穴各灸2 壮（约10 min），每日灸治1 次，共治疗7 次。药饼的主药为附子粉，隔药灸前用黄酒调和，并用动物药饼专用模具压制成药饼备用；同时用模具将艾绒压实制成锥形艾炷备用，艾炷的重量为90 mg。隔药灸操作时，将艾炷置于药饼上，放置在穴位上点燃艾炷后施灸。假灸组除不点燃艾炷外，余操作均同隔药灸组。模型组与正常组不进行任何治疗，只作与隔药灸组相同的抓取与固定。

1.5 样本处理与制备

各组大鼠干预结束后，禁食、不禁水24 h，腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉后，沿大鼠的腹正中线剪开腹部皮肤，充分暴露大鼠的直肠、结肠部分，自耻骨联合处—盲肠取下结肠，沿肠系膜纵轴剖开，取自上而下的3 cm 结肠组织，用4°C 冷生理盐水冲洗，分成3段，1段放入4%多聚甲醛溶液内固定；2段放入冻存管置于液氮内，后移入-80°C冰箱内保存备用。

1.6 指标检测方法

1.6.1 结肠组织形态学观察

HE 染色后，在光学显微镜下观察各组大鼠结肠组织形态学变化。操作步骤主要包括：结肠组织脱水、包埋、切片、烤片处理后，置于二甲苯、梯度酒精中脱蜡脱水，苏木素染色，1%盐酸酒精分化，自来水返蓝，0.5%伊红染色，再依次经梯度酒精浸泡，二甲苯透明后，中性树胶封片。

1.6.2 结肠p38MAPK、ERK1/2、c-fos蛋白检测

取出-80°C 保存的结肠组织，裂解后匀浆，离心后取上清。采用BCA 蛋白定量法测定样本蛋白浓度。ERK1/2 采用Western blot 方法检测，蛋白变性后，经电泳-转膜-封闭后，加入一抗ERK1/2（1：1000），4°C 孵育过夜，PBST 缓冲液洗膜，加入二抗（兔抗）（1：1000）室温孵育1 h，PBST 缓冲液洗膜，加入一抗GAPDH（1：1000），室温孵育3 h，PBST 缓冲液洗膜，加入二抗（兔抗）室温孵育1 h，PBST 缓冲液洗膜后，凝胶成像系统拍摄条带图，使用Image J软件分析灰度值。p38MAPK、c-fos 采用酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked Immunoserbent Assay，ELISA）测定，具体操作按试剂盒说明书进行，适当比例稀释待测样本后，在96 孔板中依次加入待测样本、亲和素、酶标试剂，充分混匀后，37°C 孵育。去除以上液体，再依次加入显色剂A、显色剂B，充分混合后，37°C 避光显色。最后，加入终止液终止显色反应。酶标仪450 nm 波长下测定OD 值，蛋白浓度与OD 值之间呈正线性关系，通过绘制标准曲线计算出标本中目的蛋白的浓度。

1.6.3 结肠p38MAPK的mRNA表达检测

采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTqPCR）检测，主要步骤包括：①组织总RNA 的抽提；②总RNA 中DNA 的消 除：DNase I 1 μL;10 × DNase I Buffer 1 μL;总RNA≦1 ng;DEPC-H2O nμL。③逆转录cDNA: RNA-Primer Mix 12 μL；5 × RT Reaction Buffer 5 μL；25 mMdNTPs 1 μL；25 U·μL-1RNase Inhibitor 1 μL;200 U·μL-1M-MLV Rtase 1 μL；Oligo (dt)18 1 μL；ddH2O（DNase-free）4 μL。PCR 扩增：SYBR Green Mix 12.5 μL；Primer F 0.5 μL；Primer R 0.5 μL；ddH2O 9.5 μL；cDNA 模板2 μL。4Real-time PCR 扩增。扩增条件：95°C，10 min（95°C，15 Sec；60°C，45 Sec）× 40；

95°C，15 Sec；60°C，1 min；95°C，15 Sec；60°C，15 Sec。记录Ct值，以GAPDH 作为内参，蛋白引物设计见表1。通过2-△Ct法计算目的蛋白mRNA 的相对表达水平。

1.7 统计分析方法

实验数据采用SPSS21.0 进行统计分析，对各组数据进行正态分布和方差齐性检验，符合正态分布资料采用X—± s 的形式表示；不符合正态分布的资料采用Median（min-max）的形式表示。若各组方差齐等，则采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行检验，有统计学意义则进一步采用LSD 检验做两两比较；若各组方差不齐，采用Game-Howell 分析。统计检验水准均为α=0.05，P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 p38MAPK mRNA实时荧光定量PCR检测引物设计

2 结果

2.1 各组大鼠结肠组织形态学变化

光镜下观察，正常组大鼠结肠黏膜、腺体形态正常，结构规则，未见炎性细胞浸润，未见溃疡。模型组结肠组织黏膜上皮缺失，腺体排列不规则，黏膜下层明显增厚，血管增生，黏膜层及黏膜下层可见较多的单核细胞和淋巴细胞浸润，淋巴组织增生，黏膜有裂隙状溃疡形成，部分溃疡可深达肠壁肌层，偶见肉芽肿形成以及纤维化瘢痕。隔药灸组可见愈合性溃疡形成，黏膜上皮较为完整，可见炎性细胞浸润，杯状细胞增生，腺体排列较为规则，黏膜下层增厚减轻，可见少量成纤维细胞及淋巴细胞浸润。假灸组大鼠结肠损伤程度、炎症反应与模型组类似（图1）。

2.2 结肠p38MAPK蛋白和mRNA的检测结果

与正常组比较，模型组大鼠结肠p38MAPK 蛋白及mRNA 表达明显增高，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。与模型组比较，隔药灸组大鼠p38MAPK 蛋白及mRNA 表达明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05）；假灸组大鼠均无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。与假灸组比较，隔药灸组大鼠p38MAPK 蛋白及mRNA 表达明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05）（表2）。

2.3 结肠ERK1/2蛋白表达的检测结果

与正常组比较，模型组大鼠结肠ERK1/2 蛋白表达明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，隔药灸组ERK1/2 蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；假灸组大鼠ERK1/2 蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。与假灸组比较，隔药灸组ERK1/2 蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（表3，图2）。

2.4 结肠c-fos蛋白检测结果

与正常组比较，模型组大鼠结肠c-fos蛋白浓度明显增高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与模型组比较，隔药灸组c-fos 蛋白浓度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；假灸组大鼠c-fos 蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P＞0.05）。与假灸组比较，隔药灸组大鼠c-fos蛋白浓度明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（表4）。

3 讨论

克罗恩病是一种慢性炎症性疾病，反复发病，临床表现多变，根据不同的临床症状，可归属于中医“腹痛”、“腹泻”、“痔漏”“积聚”等范畴。其病灶呈节段性分布，以末端回肠和邻近结肠最为常见；其病理学特点主要为节段性全壁性肠炎、裂隙状溃疡、黏膜下层增厚、淋巴细胞聚集、结节病样肉芽肿以及鹅卵石样改变等。具体病因及发病机制尚未十分明确，多与遗传、自身免疫缺陷等因素相关。其发病率呈逐年增高趋势，且复发率高，预后不佳[12]。近年来，临床研究发现艾灸能有效缓解轻、中度克罗恩病患者的临床症状及抑郁、焦虑情绪[13-16]，是治疗轻、中度克罗恩病的有效方法之一。深入研究艾灸（隔药灸）治疗克罗恩病的作用机制，有助于进一步提高临床疗效、促进临床应用。

图1 各组大鼠结肠组织HE染色结果

表2 各组大鼠结肠p38MAPK蛋白及mRNA表达的比较

表3 各组大鼠结肠ERK1/2蛋白表达的比较

表4 各组大鼠结肠c-fos蛋白浓度表达的比较

图2 各组大鼠结肠ERK1/2蛋白表达条带图

目前在炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）的研究中发现，促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族能够抑制上皮细胞增殖并促进肠道细胞凋亡[17]，且MAPK 的不同亚型在IBD患者的结肠黏膜中显著活化[18],在其发病过程中起重要的作用，其主要包括细胞外信号调节激酶（ERK/MAPK）、c-JUN 氨基末端激酶（JNK）、p38 MAPK 和ERK5/BMK1（BMK1）[19]。与其他MAPK 相比，p38 MAPK 在IBD 患者炎症肠黏膜内的活性较强[20]。Otsuka 等发现，CD 患者的结肠组织的固有肌层中p38MAPK和ERK1/2表达明显增加；且在TNBS处理的小鼠中，骨髓细胞特异性缺失p38 小小鼠较正常小鼠炎症表现较轻和疾病状况得到改善[21]。Mulsow等发现，在复发性CD 狭窄患者中，可以通过抑制ERK 1/2 MAPK 信号传导降低TGF-导促纤维化作用，有望成为治疗CD 的新靶标[22]。Ko 等发现结肠上皮细胞中类杆菌毒素能导致MAPK 信号传导的快速激活，活化的MAPK 信号通过肠上皮细胞中的IKK-NF-κB 信号传导途径诱导HO-1 分子诱导细胞凋亡[23]，而肠上皮细胞的凋亡是其炎症发生的主要相关因素[24]，Piegholdt等的研究表明生物素A 和prunetin 可通过下调ERK 来改善上皮功能[25,26]。Zhang 等人发现MBF-DE 通过抑制NF-κB/p65 和MAPK/p38/ERK 信号减弱了LPS 诱导的结肠炎症反应[27]。Ihara 等发现，在结肠炎期间，ERK 和p38MAPK 对卡巴胆碱诱导的肠道收缩的作用显著，导致结肠平滑肌收缩功能障碍[28]。这些研究均提示了p38MAPK、ERK 信号级联反应可能是CD 发病的重要途径之一。本课题组前期研究发现，隔药灸可以调节CD 大鼠结肠MAPK 家族中JNK 信号通路相关蛋白的表达，起到缓解炎症、促进结肠损伤愈合的作用[29]。在此基础上，研究隔药灸对MAPK 家族中其他蛋白及相关通路的影响，进一步完善隔药灸对MAPK信号通路的调控机制，有助于全面阐释隔药灸治疗克罗恩病的作用机制。

在本研究中，模型组结肠组织黏膜上皮缺失，黏膜层及黏膜下层可见较多的单核细胞和淋巴细胞浸润，有裂隙状溃疡形成。与正常组比较，模型组大鼠结肠炎症表现明显，且p38MAPK 和ERK1/2 的表达也较正常组明显升高，提示p38MAPK 和ERK1/2 的过度表达可能与肠道的炎症性表现密切相关；同时ERK1/2下游c-fos 蛋白水平也明显升高，与文献报道一致[30]。c-fos能够诱导结肠上皮细胞生长、增殖、分化和凋亡，参与了结肠黏膜的损伤过程。与模型组比较，隔药灸组可见愈合性溃疡形成，黏膜上皮较为完整，p38MAPK、ERK1/2、c-fos 的表达也明显降低，提示：隔药灸能下调克罗恩大鼠结肠p38MAPK、ERK1/2、c-fos的表达，改善肠道炎症、促进肠道组织修复；下调结肠p38MAPK、ERK1/2、c-fos 表达可能是隔药灸治疗CD 的抗炎机制之一。本研究仅观察了隔药灸对MAPK信号通路靶蛋白p38 MAPK、ERK1/2、c-fos的影响，缺少对p38MAPK和ERK 信号通路激活调节途径的研究，尚需在此基础上进一步开展研究，有助于较为全面地揭示隔药灸对克罗恩病结肠MAPK信号通路的调控作用及相关机制。