川黄连多指标成分定量及特征图谱建立研究＊

吴晓青，时晓媞，蒋合众，魏 屹，任瑶瑶，谭 睿

（西南交通大学生命科学与工程学院 成都 610031）

黄连（Coptidis Rhizoma）始载于《神农本草经》，列为上品，为历代医家常用清热燥湿的首选药之一。《中华人民共和国药典》（2015 版）收载黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch、三角叶黄连Coptis deltoideaC． Y． Cheng et Hsiao．或云连Coptis teetaWall．的干燥根茎[1]。主产于四川、重庆、贵州、西藏、湖南、云南、陕西等省区，川黄连一直以来被认为是黄连的道地产区，因基源不同，药材分为“味连”、“雅连”和“凤尾连”。

黄连根茎中含小檗碱、黄连碱、表小檗碱、甲基黄连碱、巴马汀、药根碱、非洲防己碱、小檗红碱、木兰花碱、格陵兰黄连碱等[2]。其含量测定方法主要有薄层扫描法、高效液相色谱法等。文献报道的采用HPLC测定黄连及其炮制品中生物碱含量的方法，最多同时测定6个主要生物碱含量，且多集中于味连[3-6]，未能区分不同种黄连的品质。本文采用RP-HPLC 建立了黄连中7个小檗型生物碱的含量测定方法，比较了味连、雅连和峨眉野连3 种川产药材的7 个生物碱含量的差异，通过含量的差异来评价不同种川产黄连的品质。川黄连由于生长环境、气候条件等因素其物质基础存有差异，指纹图谱分析方法作为控制黄连药材的质量方法之一，现有文献报道中多以味连为研究对象建立指纹图谱[7-9]，而对雅连和凤尾连研究较少[10]。本文拟建立川产味连、雅连、凤尾连的HPLC 特征图谱，以对比3 个品种之间的差异，为川产黄连的品质评价提供实验数据支撑。

1 川黄连7个生物碱成分含量测定

1.1 材料

Angilent1260-II 型高效液相色谱仪；BS-110S 电子分析天平（北京赛多利斯电子天平有限公司）；超声波清洁器（昆山市超声仪器有限公司）。

格陵兰黄连碱、表小檗碱、药根碱、黄连碱、巴马汀购于成都普思生物生物科技有限公司（批号分别 为 PS161130-03、PS161130-01、PS161124-01、PS161201-01、PS161130-02，含量≥98%），非洲防己碱购于成都曼斯特生物科技有限公司（批号为MUST-14072213，含量≥98%），盐酸小檗碱购于中国食品药品检定研究院（批号为110713-200911，含量≥98%）。甲醇、乙腈（色谱纯，sigma）；三乙胺、磷酸、十二烷基苯磺酸钠、磷酸二氢钾均为分析纯。

本课题组野外采集黄连药材15 批，含味连6 批，雅连6 批，凤尾连3 批，均由西南交通大学生命科学与工程学院宋良科教授鉴定为黄连Coptis chinensis（味连）、三角叶黄连Coptis deltoidea（雅连）、峨眉野连Coplis omeiensis（凤尾连）。详细产地及编号见表1。

表1 黄连产地及编号

1.2 方法与结果1.2.1 色谱条件

色 谱 柱Angilent Eclipse XDB-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.4%磷酸二氢钾（含有0.4%十二烷基磺酸钠，0.6%三乙胺，磷酸调节pH 9.0）（34∶66）水溶液；流速1.0 mL·min-1；柱温35 ℃；检测波长345 nm；进样量10 μL。7个生物碱的混合对照品以及3种黄连药材HPLC图见图1。

图1

1.2.2 对照品溶液的制备

分别精密称定7 种对照品适量，加盐酸甲醇溶液（1∶100），溶解制得每1 mL 含有1 mg 的对照品储备液。精密吸取各对照品储备液适量，配制成每1 mL分别含格陵兰黄连碱、表小檗碱、非洲防己碱、药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱为0.026、0.043、0.030、0.031、0.019、0.029、0.067 mg·mL-1的混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备

取黄连粉末约0.1 g（过三号筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL盐酸甲醇（1∶100），密塞，称定重量，超声提取45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，放置，取上清液，过0.45 μm 微孔滤膜，即得供试品溶液。

1.2.4 方法学考察

（1）线性关系考察

分别精密吸取1.2.2项下各对照品储备溶液，用盐酸甲醇（1∶100）溶液分别稀释成一系列浓度的混合对照品溶液。按1.2.1色谱条件注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以峰面积Y为纵坐标，进样量（μg）为横坐标，进行回归分析，得回归方程、相关系数（r）及线性范围（表2）。结果表明，格陵兰黄连碱、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱7个生物碱分别在0.052 73-1.055（r=0.999 8）μg，0.085 76-1.715（r=0.999 9）μg，0.051 38-1.028（r=0.999 9）μg，0.038 45-0.769 0（r= 0.999 9）μg，0.0384 1-0.768 2（r=0.999 9）μg，0.057-1.141 0（r= 0.999 9）μg，0.134 2-2.684（r=0.999 9）μg，呈良好的线性关系。

表2 黄连生物碱含量测定结果（%，n=3）

图2 15批黄连的HPLC特征图

（2）精密度试验

精密吸取同一混合生物碱对照品溶液，按1.2.1项色谱条件注入高效液相色谱仪，重复进样6次，记录峰面积值，计算RSD。各生物碱峰面积RSD 分别为0.97%、0.63%、0.84%、0.56%、0.54%、0.76%，表明方法有较好的精密度。

（3）稳定性试验

取雅连样品0.1 g，精密称定，按1.2.3 项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 时间按1.2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算RSD 值。峰面积的RSD 分别为1.11%、1.17%、2.89%、0.60%、0.33%、1.40%、0.63%，说明供试品溶液在24 h内稳定可用。

（4）重复性试验

取0.1 g 的雅连样品6 份，精密称定，按1.2.3 项下方法制备供试品溶液，按1.2.1项下色谱条件注入高效液相色谱仪，记录峰面积，计算含量，计算RSD 值。所测含量的RSD 分别为1.74%、1.58%、1.90%、2.16%、2.01%、2.17%、1.64%，结果表明供试品溶液的制备方法重复性良好。

（5）加样回收率试验

取雅连样品6 份，精密称定，每份0.1 g，分别精密加入等量的混合对照品溶液，按1.2.3项方法制备供试品溶液，按1.2.1 项色谱条件进样，计算加样回收率。格陵兰黄连碱、药根碱、非洲防己碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱平均回收率分别为97.07%、99.26%、101.60、99.43、98.62%、98.67%、98.68%，RSD分别为1.07%、0.66%、0.47%、0.47%、0.27%、0.37%、0.29%。表明本法具有较好的回收率。

（6）样品测定

精密称取黄连粉末0.1 g，按1.2.3项方法制备供试品溶液，将供试品溶液和对照品溶液各10 μL 进样分析，分别测定不同品种黄连的生物碱含量，结果见表2。

结果表明：总生物碱含量：味连＞凤尾连＞雅连；小檗碱含量：味连＞凤尾连＞雅连；巴马汀含量：味连＞雅连＞凤尾连；黄连碱：味连＞凤尾连＞雅连；表小檗碱含量：味连＞雅连＞凤尾连，非洲防己碱含量：味连＞凤尾连＞雅连；药根碱含量：雅连＞凤尾连＞味连；格陵兰黄连碱含量：雅连＞凤尾连＞味连。

2 川黄连特征图谱的建立

2.1 材料

药材：15 批药材（1-15 号），产地、品种及编号见详表1。

2.2 方法与结果

2.2.1 色谱条件

色 谱 柱Angilent Eclipse XDB-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。乙腈（A 相）-0.5%磷酸二氢钾（三乙胺调pH=9.0）（B相）水溶液为流动相梯度洗脱。线性梯度洗脱程序为：0-15 min，10%A；15-20 min，25%A；20-25 min，30%A；25-45 min，34%A；45-85 min，50%A；85-100 min，10%A。检测波长：305 nm；流速：0.7 mL·min-1，进样量10 μL；柱温35℃。

2.2.2 供试品溶液制备

取黄连粉末约0.1 g（过三号筛），精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 盐酸甲醇，密塞，称定重量，超声提取45 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，放置，取上清液，过0.45 μm 微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2.3 精密度试验

取雅连药材，按2.2.2项供试品溶液方法制备供试品溶液，按2.2.1 项色谱条件，在48 h 内按色谱条件连续进样6 次，记录色谱图。结果表明，以14 号色谱峰(小檗碱)为参照峰，各色谱峰相对保留时间、相对峰面积RSD均在3.0%内，表明该仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性试验

取2 号雅连药材，精密称定，按2.2.2 项供试品溶液方法制备供试品溶液，按2.2.1 项色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，记录色谱图。结果表明，以14号色谱峰(小檗碱)为参照峰，各色谱峰相对保留时间、相对峰面积RSD 均在3.0%内，表明药材供试品溶液24 h内稳定性良好，符合要求。

2.2.5 重复性试验

取2 号雅连药材6 份，制备供试品溶液，分别进样，记录色谱图。结果表明，以14 号色谱峰（小檗碱）为参照峰，各色谱峰相对保留时间、相对峰面积RSD均在3.0%内，表明仪器重现性良好。

2.2.6 15批黄连药材特征图谱的建立及共有峰的指认

取15 批黄连药材，精密称定，按2.2.2 项供试品溶液方法制备供试品溶液，按2.2.1 项色谱条件，分别进样，记录色谱将色谱图通过《中药色谱指纹图谱评价系统（2012A 版）》进行相似度分析，采用平均数方法，时间窗宽度为0.3，进行自动匹配色谱峰将多个色谱图进行比较，得到共有模式色谱图。15 批黄连药材特征图谱色谱图见图2，特征图谱共有模式见图3。

通过软件分析，选取峰面积在0.001%以上，峰形较好，分离度较好，保留时间的RSD 小于0.30%的色谱峰，结果表明，15 批黄连药品共有15 个共有峰。黄连共有峰15个，分别编号1-15号，如图4所示，经与黄连生物碱对照品比对，得出14 号峰为小檗碱、13 号峰为巴马汀，11 号峰为黄连碱、10 号峰为表小檗碱、9 号峰为非洲防己碱、8号为药根碱、7号为格陵兰黄连碱、2号峰为木兰花碱。

图3 15批黄连共有模式对照图谱

图4 特征峰的指认

2.2.7 不同种黄连的特征图谱相似度分析

分别将6 批味连、6 批雅连和3 批凤尾连的色谱图通过《中药色谱指纹图谱评价系统（2012A版）》进行相似度分析，采用平均数方法，时间窗宽度为0.3，进行自动匹配色谱峰将多个色谱图进行比较，得到对照特征图谱。

结果表明，味连共有峰16 个，雅连共有峰20 个，凤尾连共有峰21 个。通过对3 种黄连的对照指纹图谱的相似度分析，凤尾连与味连对照特征图谱相似度为0.991，凤尾连与雅连对照特征图谱相似度为0.993，味连和雅连对照特征图谱相似度为0.980。凤尾连与雅连在成分上更相似。

3 讨论

本文采用RP-HPLC 法对6 批味连、6 批雅连、3 批凤尾连的生物碱含量进行了分析，建立了味连、雅连、凤尾连的特征指纹图谱，并标定共有峰，味连共有峰16 个，雅连共有峰20 个，凤尾连共有峰21 个。各批次共有峰峰面积的RSD 值均＜5%。同时测定了味连、雅连和凤尾连3 种川产药材的7 个生物碱含量。3 种川产黄连所含7个生物碱比例各不相同，据此可根据7个生物碱含量比例差别，来初步鉴定3种品种来源。

文献报道的HPLC 测定的黄连及其炮制品的方法中多采用离子对色谱法（《中华人民共和国药典》2015年版一部黄连项下采用十二烷基硫酸钠，以磷酸调节pH 值为4.0），但是该条件下黄连中药根碱和表小檗碱的分离度达不到要求。在pH 2.0 时，表小檗碱和药根碱峰完全重合；在pH 4.0 时，表小檗碱和药根碱略有分开；在pH 6.0 时，表小檗碱和药根碱的分离度分别为0.94 和1.34。在pH 9.0 时，表小檗碱和药根碱的分离度分别为11.59、4.63。本文采用三乙胺为流动相改性剂，在碱性条件下对3 种川黄连饮片中7 个生物碱进行分离，可将药根碱、表小檗碱完全分离，实现了同一色谱条件下同时测定3 种川黄连饮片中7 个主要生物碱的含量。文献报道的采用HPLC 测定黄连生物碱含量的方法，最多同时测定6个主要生物碱含量，且研究集中在味连、雅连和凤尾连鲜有研究。在《中国药典》2015 年版一部黄连项下也仅建立了以小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀等4个生物碱成分的一测多评法。课题组前期研究发现，味连与雅连能改善2型糖尿病大鼠糖及脂代谢紊乱[11,12]。本研究发现，雅连药根碱和格陵兰黄连碱的含量明显高于味连，可作为雅连的特征成分，这种变化是否与雅连治疗“消渴”最优相关?是否还有其他成分的协同作用?有待进一步系统研究。