通精灵对精索静脉曲张模型大鼠生精细胞凋亡及凋亡因子Cyt C、caspase-9的影响

刘冰崔云杜宝昕郑军状李培轮刘擎任国庆方腾铎

1.浙江中医药大学第三临床医学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学附属宁波中医院3.重庆市中医院 4.浙江慈溪市中医医院

精索静脉曲张（aricocele，VC）是指精索内蔓状静脉丛异常扩张和弯曲，在正常人群中发病率约为15%，其中20%患者伴有生育问题[1-3]。VC与男性生育能力关系密切，是男性不育的重要原因之一，但其具体机制尚未明确。多项研究发现，VC可导致睾丸组织病理损伤，生精细胞过度凋亡，从而引起精子数量减少和活力减弱，影响男性生育能力[4-6]。生精细胞凋亡异常可能是VC影响男性生育能力分子机制之一。中医药治疗在治疗精索静脉曲张不育症方面有其独特优势，导师崔云教授为第六批全国老中医药专家学术经验继承工作指导老师，崔师根据多年临床经验所创立的自拟方通精灵，切合本病病机，可有效提高VC致不育患者精子活力[7]。同时，本课题组前期研究初步发现，通精灵可有效降低VC模型大鼠睾丸生精细胞的凋亡指数，降低凋亡相关因子半胱氨酸蛋白酶-3（cysteine aspartic acid specific protease-3，capase-3）的表达[8]。基于此，本实验以Wistar大鼠建立实验性VC模型，观察通精灵对睾丸组织形态影响，明确其对VC模型大鼠生精细胞凋亡的调控作用，并更进一步检测其对生精细胞凋亡的关键因子细胞色素C（cytochrome C，Cyt C） 和半胱氨酸蛋白酶-9（cysteine aspartic acid specific protease-9，caspase-9）表达的影响，以更全面、系统地探讨通精灵改善睾丸组织损伤、抑制生精细胞过度凋亡的作用机制，为临床治疗提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物和饲养条件 雄性SPF级Wistar大鼠72只，3月龄，体质量（350±20）g，采购于上海 BK 公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016]，委托浙江中医大学实验动物中心饲养[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2013-0184]。饲养条件：温度（24±2）℃，湿度 50%～70%，12h光暗循环，自由饮水、饮食，定期清洁消毒。

1.2 主要实验仪器 EG1150H石蜡包埋机（德国Leica公司）；RM2235切片机（德国Leica公司）；HI1210烤片机（德国 Leica公司）；Nikon eclipse 80i显微镜（Nikon公司）；流式细胞仪（NovoCyte公司）；微量加样器（Thermo公司）；QL-861型涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；D-37520台式高速冷冻离心机（Thermo Fisher公司）；Thermo Varioskan Flash多功能酶标仪（Thermo Fisher公司）；Mini-Proten Tetra System电泳系统（Bio-rad公司）；ChemiDoc XRS+System凝胶成像仪（Bio-rad公司）。

1.3 主要实验试剂 TUNEL染色试剂盒购于南京建成生物工程研究所（批号：G001-1）；Annexin VFITC/PI凋亡检测试剂盒购于Multi Sciences公司（批号：AP101）；BCA蛋白浓度测定试剂盒为碧云天生物技术研究所产品（批号：P0010）；Cyt C抗体购于CST公司（批号：#11940）；caspase-9抗体购于abcam公司（批号：ab32539）；ECL Plus发光试剂盒购于Bio-Rad公司（批号：#1705061）。

1.4 实验药物 中药复方通精灵由柴胡10g、丹参30g、红花 6g、菟丝子 10g、五加皮 10g、枸杞子 10g、三七粉3g、炒露蜂房10g、煅龙骨30g、煅牡蛎30g等组成，将上述药物放入高压自动煎药机内，加10倍量的水，115℃、0.10Mpa高温高压煎煮1h，将第1次水煎液倒出过滤，煎煮后的药物再继续加水，连续煎煮3次，将全部水煎液合并，置于旋转蒸发仪内，旋蒸浓缩为 1.6g、3.2、6.4g·mL-1的水煎剂，4℃冷藏备用。左卡尼汀口服液购于东北制药集团沈阳第一制药有限公司（批号：#161153）。

1.5 方法

1.5.1 分组 依据随机数字表法将大鼠随机分为6组：假手术组、模型组、通精灵低剂量组、通精灵中剂量组、通精灵高剂量组和左卡尼汀组，每组12只。

1.5.2 模型建立及给药 参照相关文献建立VC模型[9-10]。方法如下：大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，剂量40mg/kg，麻醉后于剑突下行腹部正中切口，将腹内容物轻推向右上腹，于左侧腹膜后显露左肾静脉，游离部分左肾静脉，以一直径0.8mm的光滑金属探针置于左肾静脉下一并结扎，结扎完成后小心抽出金属探针，借此以使左肾静脉部分复通，游离结扎左精索内静脉与左髂总静脉的交通支。假手术组只行肾静脉分离不结扎，左精索内静脉与左髂总静脉的交通支只作游离不结扎，然后缝合腹壁。2周后，参考文献[10]，采用“夹尾激怒法”建立中医肝气郁结、经络瘀阻、肾精不足的精索静脉曲张大鼠模型。

造模4周后给药，根据动物实验方法学[11]，大鼠用药剂量按照60kg成人用量的6.3倍进行换算，换算后通精灵低、中、高剂量组分别予，1.6、3.2、6.4g·mL-1浓度的水煎液灌胃；左卡尼汀成人临床用量为2g[12]，换算为大鼠用药浓度为 0.021g·mL-1；假手术组及模型组大鼠均给予0.9%氯化钠溶液灌胃。各组灌胃体积均为1mL/100g体质量，1次/d，连续8周。

1.5.3 HE染色观察睾丸组织形态学 给药结束后，禁食不禁水12h，麻醉后分离各组大鼠左侧睾丸组织，称重后固定、脱水、石蜡包埋、切片，按HE染色步骤进行染色，光镜下观察各组大鼠睾丸组织形态学变化。

1.5.4 TUNEL法及Annexin V-FITC检测睾丸生精细胞凋亡 取睾丸组织石蜡切片，按TUNEL染色试剂盒步骤检测睾丸生精细胞凋亡情况。细胞核染为棕黄色，即为凋亡细胞。

睾丸生精细胞凋亡的检测严格按照Annexin VFITC试剂盒步骤进行操作，步骤如下：将0.9%氯化钠溶液6mL预热至37℃，取适量睾丸组织放入其中，剪碎并摇匀，以200目滤网过滤后计数生精细胞，以0.9%氯化钠溶液将细胞数量调整至2×106/mL备测。加入500μL的1×Binding Buffer重悬细胞，再分别加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的 PI，轻柔涡旋混匀后，避光室温孵育5min，流式细胞仪检测。

1.5.5 Western blot法测大鼠睾丸组织中Cyt C和caspase-9蛋白表达 取大鼠睾丸组织50～100mg，PBS清洗2遍，加入蛋白裂解液，冰上研磨30s，静置10min；4℃、13 000r/min 离心 30min，取上清液，重复1次；BCA法蛋白测定浓度；100℃沸水浴，灭活蛋白5min。在15%分离胶和5%浓缩胶上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜，5%脱脂奶粉封闭；4℃一抗孵育过夜，洗膜3次，室温孵育二抗2h、洗膜3次、ECL化学发光显影，Imaege J灰度扫描。

1.6 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。满足方差齐性的计量资料，进一步两两比较采用LSD-t检验；方差不齐者，采用Dunnett T3法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠模型建立情况 在实验过程中，模型组2只大鼠术后不明原因死亡；通精灵中剂量组1只大鼠术后不明原因死亡、1只大鼠造模后精索静脉曲张直径小于0.5mm，没有纳入后续实验；假手术组1只大鼠术后不明原因死亡；通精灵高剂量组1只大鼠因灌胃误入肺中后死亡，故最终建模成功纳入研究的动物数量为66只。

2.2 各组大鼠睾丸组织形态观察 光镜下观察可见，假手术组睾丸生精小管内各级生精细胞排列整齐、致密，层次清楚，结构正常。各级生精细胞发育良好，生精小管管腔内可见大量精子。见图1A。模型组睾丸生精小管内生精细胞排列紊乱，层次减少，甚至全无。基底膜损伤、变薄，精原细胞、精母细胞、精子细胞全部脱落，生精细胞脱落至生精小管管腔内，可见管腔阻塞，管腔内少见精子。见图1B。通精灵低剂量组睾丸生精小管内各级生精细胞排列仍较紊乱，层次较不明显，部分生精小管腔内仍可见大片脱落的生精细胞阻塞管腔，管腔内可见少量精子。见图1C。中剂量组中睾丸生精小管内各级生精细胞排列整齐、致密，层次分明，生精细胞数量正常，管腔内无脱落的生精细胞，其内可见大量精子。见图1D。高剂量组睾丸生精小管内生精细胞按正常分化序列排列，层次较清楚，细胞结构清楚，着色正常，精原细胞及其他各级生精细胞的数量轻度减少。见图1E。左卡尼汀组睾丸生精小馆内各级生精细胞排列较整齐、稍疏松，层次较不明显，极少数管腔内有少量生精细胞脱落。各级生精细胞数量轻度减少，管腔内可见少量精子。见图1F。

2.3 各组大鼠睾丸组织生精细胞凋亡比较 TUNEL结果显示，与假手术组比较，模型组睾丸生精细胞凋亡数目较多，各级生精细胞中均可见凋亡的生精细胞；通精灵各组及左卡尼汀组生精细胞凋亡的数目较少，其中通精灵中、高剂量组及左卡尼汀组凋亡生精细胞的数目明显少于模型组，通精灵低剂量组凋亡的生精细胞略少于模型组，且各干预组凋亡的生精细胞多集中于靠近生精小管基底部的精原细胞、初级精母细胞处。见图2。

Annexin V-FITC结果显示，各组大鼠生精细胞凋亡率存在明显差异。与假手术组比较，模型组生精细胞凋亡率升高（P＜0.05）；通精灵中、高剂量组及左卡尼汀组生精细胞凋亡率均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。与模型组比较，通精灵低剂量组生精细胞凋亡率降低不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

图1 各组大鼠睾丸组织形态学改变比较（HE染色，100×）Fig.1 Comparison of the morphological changes in the testis of rats in each group(HE staining,100×)

图2 各组大鼠睾丸生精细胞凋亡情况（DAB染色，400×）Fig.2 Apoptosis of spermatogenic cells of rat testis in each group(DAB staining,400×)

表1 各组大鼠生精细胞凋亡率比较（%）Tab.1 Comparison of the apoptosis rate of spermatogenic cells in each group(%)

2.4 各组大鼠睾丸组织中Cyt C、caspase-9蛋白表达比较 Western blot检测发现，与假手术组比较，模型组中大鼠睾丸组织中Cyt C、caspase-9蛋白表达显著增加（P＜0.01）。与模型组比较，通精灵低剂量组中Cyt C、caspase-9蛋白表达无统计学差异（P＞0.05）；通精灵中、高剂量组Cyt C、caspase-9蛋白表达显著减少（P＜0.01）；同时左卡尼汀组中Cyt C、caspase-9蛋白表达也减少，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。而且，通精灵高剂量组中Cyt C、caspase-9蛋白表达明显少于左卡尼汀组（P＜0.05，P＜0.01）。见图3、4。

图3 各组大鼠睾丸组织中Cyt C、caspase-9蛋白表达比较Fig.3 Comparison of expression of Cyt C and caspase-9 protein in testis of eachgroup

图4 各组大鼠睾丸组织Cyt C、caspae-9蛋白相对表达量比较Fig.4 Comparison of relative expression of Cyt C and caspase-9 protein in testis of each group

3 讨论

中医文献中并无精索静脉曲张不育症的病名，当属中医学“筋瘤”“筋疝”等范畴。明·陈实功[13]《外科正宗》云：“筋瘤者，坚而色紫，垒垒青筋，盘曲甚者结若蚯蚓。”清·陈士铎[14]《洞天奥旨·筋瘤骨瘤石瘤》中曰：“筋瘤者，乃筋结成于体上也。初起之时，必然细小，按之如筋也，筋蓄则曲，曲久成瘤而渐大矣。”其描述与VC的临床表现相似，而对于本病病因病机的认识，中医学尚未形成统一意见。导师崔云教授根据其多年临床经验，结合经络学说及肝肾同源理论，认为本病的病理机制当为肝郁血瘀肾虚，并指出“肝郁”“血瘀”“肾虚”为本病发生发展的三大关键环节，贯穿本病的全程。肝气郁结、气失条达是男性不育关键之一，正如清·陈士铎[15]在《石室秘录·论子嗣》所云：“男不能生子者有六病……六病维何？一精寒也，一气衰也，一精少也，一痰多也，一相火盛也，一气郁也。”血瘀是本病发病的中心环节，肝气郁结可致脏腑气血功能紊乱，气血运行不畅，瘀血内生，阻于精室，从而降低男性生殖能力。清·张锡纯[16]在《医学衷中参西录》中认为精室为“生精之处”和“化精之所”。肾虚为本病发病的核心，中医学认为肾藏精，主生殖发育，因此肾与生育能力密切相关，男性不育症主要责之于肾。肾之生殖之精要得以正常化生，必须有赖于气血的旺盛与畅达，若气血运行不畅，血液瘀阻于精络中，瘀久化毒，瘀毒内蕴，日久则外肾受损，生殖之精生成不足。因此，“肝郁”“血瘀”“肾虚”为导致精索静脉曲张不育的三大关键因素。一方面，三者作为一个整体共同引起本病的发生；另一方面，三者之间又相互影响，互为因果，形成一个恶性循环。随着病情的发展，年龄的增长，肾气的衰退及诊治是否得当等因素的影响，又可形成本病反复迁延，缠绵难愈的临床特点。基于此，导师崔云教授创立了治疗VC不育症的经验方通精灵。通精灵由柴胡、丹参、红花、菟丝子、五加皮、枸杞子、三七粉、炒露蜂房、煅龙骨、煅牡蛎组成，全方切合本病肝气郁结、经络瘀阻、肾精不足之病机，寒温并用、补涩兼施，共奏疏肝通络、活血祛瘀、补肾强精之效。通精灵临床效果显著，可显著改善VC患者术后精液质量，提高其配偶妊娠率[17]。现代药理学也证实，方中主要中药具有改善患者精子质量、抗氧化、调控细胞凋亡等作用。

目前，多数学者认为VC可以引起睾丸组织损伤、睾丸生精障碍，从而降低男性生育能力。其相关分子机制包括睾丸微循环障碍、睾丸温度差异的缺失、缺氧、氧化应激、代谢产物反流堆积、免疫因素、生精细胞凋亡异常等，而上述分子机制又均与生精细胞的凋亡密切相关[18-20]。生精细胞凋亡异常可能是VC致男性不育机制中的关键环节，发生VC时睾丸生精细胞凋亡增加，精子数量减少，从而导致不育[21]。张长城等[22]研究发现，采用左肾静脉部分结扎法建立实验性VC大鼠模型后，各模型组中睾丸生精细胞凋亡数目及凋亡率明显高于假手术组。笔者前期研究表明，VC模型大鼠睾丸生精细胞凋亡率明显高于假手术组[23]。本实验通过HE染色观察到，模型组大鼠出现睾丸生精小管内生精细胞排列紊乱、生精细胞脱落、管腔阻塞等明显的病理损伤，而通精灵各剂量组睾丸组织中病理损伤明显改善。TUNEL染色及Annexin V-FITC检测发现，模型组生精细胞凋亡率明显高于假手术组；而通精灵中、高剂量组中睾丸生精细胞凋亡率显著低于模型组，这证实VC可导致睾丸组织病理损伤，影响生精细胞的凋亡，而通精灵可以有效改善这种病理损伤，防止生精细胞过度凋亡。

细胞凋亡被称作Ⅰ型程序性细胞死亡，是由基因控制的细胞自主、程序化的死亡方式。正常情况下，生精细胞凋亡是机体清除多余或受损的生精细胞方式之一，对于调控生精细胞数量，维持生殖内环境稳定发挥重要作用[4]。目前已知细胞凋亡至少存在3种途径，分别是线粒体途径、死亡受体途径、内质网途径[24]。前期研究结果发现，VC模型大鼠睾丸组织中抑制生精细胞凋亡的Bcl-2表达下调[22]，而 Bcl-2与线粒体Cyt C的释放密切相关[25]。Cyt C是线粒体呼吸链的重要组成部分，可以诱导蛋白水解和活化caspase级联，是细胞凋亡过程的关键靶点。鉴于此，本实验从线粒体途径探讨通精灵调控VC模型大鼠生精细胞过度凋亡的作用机制。正常情况下，Cyt C位于线粒体内外膜之间，当细胞受到各种刺激后，Cyt C从线粒体内释放进入细胞质中，与凋亡酶激活因子-1（apoptosis protease activating factor-1，Apaf-1）分子结合，促使Apaf-1的构象发生改变，caspase-9前体与Apaf-1氨基端结合，形成“凋亡小体”，在胞质中脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate，dATP）的作用下进一步激活。caspase-9是线粒体凋亡途径中Cyt C下游重要的作用元件，参与了细胞凋亡的启动，活化后的caspase-9能激活细胞凋亡执行者caspase-3，最终导致细胞凋亡[26-28]。本实验结果发现，模型组中大鼠睾丸组织中Cyt C和caspase-9的表达明显升高，而通精灵中、高剂量组及左卡尼汀组中Cyt C和caspase-9的表达不同程度降低。说明通精灵可能是通过抑制线粒体Cyt C的释放，下调caspase-9的表达，从而抑制VC模型大鼠生精细胞的过度凋亡。

综上所述，通精灵可以有效改善VC大鼠睾丸组织的病理损伤，通过降低Cyt C和caspase-9的表达，调控caspase凋亡级联反应，减少生精细胞的凋亡，从而提高男性生育能力，这可能是通精灵治疗VC不育的分子机制。相关文献表明，Cyt C所介导的caspase凋亡级联反应，主要为凋亡相关蛋白间的相互作用，是相关蛋白构象发生改变而带来的结果；同时，蛋白质是基因功能的执行者，蛋白间相互作用才是执行功能的主要途径[28-29]。故本实验主要在蛋白水平对Cyt C和caspase-9的表达进行了检测，以期明确通精灵调控生精细胞凋亡的途径。然而鉴于细胞凋亡途径的多样性，通精灵是否也可以通过其他途径调控生精细胞凋亡，从而发挥中药复方多靶点、多途径、多效应的作用优势，尚有待进一步深入研究。