基于线粒体COI序列的中国前鳞遗传多样性分析*

黄镇宇 章 群 卢丽锋 周 琪 唐楚林

(暨南大学生态学系 广州 510632)

遗传多样性是物种生存与进化的物质基础，开展鱼类遗传多样性研究可以为遗传育种和种质资源保护提供重要参考(Ward,2000)。动物线粒体属于母系遗传，无遗传物质的重组，且其进化速度比核基因快，较少的样本就可较好地反映该种群的遗传结构，是动物遗传多样性研究中理想的分子标记(Xuet al,2014)。而且，动物线粒体的COI序列具有一定的进化变异，可以较好地反映同种生物的不同群体间的遗传差异，除了被广泛应用于DNA条形码的研究中，也适用于遗传多样性的分析研究(柳淑芳等, 2016;Changet al, 2016; Xuet al, 2012; 李大命等, 2017)。

1 材料与方法

1.1 样本采集、匹配引物、测序

1.2 数据处理

运用MEGA 7.0(Kumaret al, 2016)对测序峰图进行人工校对，并计算碱基组成、颠换率。通过DnaSP 5.10计算单倍型数、单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(π) (Libradoet al, 2009)。使用 Network (Bandeltet al,1999)分析单倍型的分布情况，通过Arlequin 3.5进行AMOVA 分析、核苷酸错配分析、Tajima’sD和 Fu’sFs中性检验，计算群组间的Fst值、SSD值、Rg值、τ值等参数(Excoffieret al, 2010)。运用SAMOVA 2.0进行空间分子变异分析。根据公式[T=(τ/2μk)×代时]计算种群扩张时间，其中，τ、μ、k、T依次代表种群扩张时间参数、序列的变异速率[线粒体COI基因进化速率为(1%～3%)/百万年(Wanget al, 2013)]、序列长度以及种群扩张时间(Rogerset al, 1992)。是属的代表性鱼类，个体较大，与前鳞的生态习性相近，其性成熟需要 2～3年(石琼等, 2015)。大多数鱼类因性成熟而迎来个体生长的停滞(钱国英, 2000)，同属的前鳞个体较小，故其性成熟所需时间可能短于鱼，但目前尚没有确切时间的报道，估算其大概为1～3年，即公式中的代时取值为1～3。

1.3 中国前鳞群体划分

2 结果与分析

2.1 前鳞线粒体COI序列特征和遗传多样性

在全长为712 bp的序列中，没有发现碱基的插入和缺失，碱基A、T、C和G的含量分别为23.5%、29.4%、28.8%和18.3%，A+T含量(52.9%)略高于C+G含量(47.1%)，与其他硬骨鱼类COI序列碱基组成特征基本一致。其中，共有 18个多态位点、6个简约信息位点，颠换与转换的比值为 4.7，表明序列的突变尚未达到饱和，适合进行系统发育分析(Kumar,2005)。此外，还发现21个单倍型，总体遗传多样性偏低(Hd=0.4840±0.0700，π=0.0010±0.0002)，其中，洞头群体最高，岱山群体最低，东海群体的遗传多样性高于南海群体，具体的遗传多样性情况见表1。

单倍型最大简约性网络图(图 1)呈现星状结构，其中，Hap1的数量最多(59)，由全部群体共享。Hap3的数量为3，由东兴群体与平潭群体共享。Hap11的数量为2，由平潭群体与洞头群体共享，其余均为各个群体特有的单倍型。也就是说，不同地理来源的个体相互聚集分布，不同的地区中存在相同的单倍型，表明前鳞在中国沿海范围内没有明显的地理聚群。

在AMOVA分析(表2)中，按照上文的群体划分进行分析：东兴、平潭、闸坡、广东、洞头等5个群体间的Fst=-0.0221～0.0141(P>0.05)，组间的遗传变异比例达-0.26%。东海群体与南海群体间的Fst= 0.0020(P>0.05)，组间的遗传变异比例达 0.46%。东兴、广东、东海3个群体间的Fst= -0.0159～0.0141 (P>0.05)，组间的遗传变异比例为-0.6%。上述各类划分中，群体间的Fst值皆小于 0.05，均表现出不显著水平(P>0.05)，且组间的遗传变异比例均属于极低水平，表明中国前鳞群体在各个地区、海域、海峡间没有明显的遗传分化，遗传变异主要集中在群体中的个体间。而 SAMOVA分析(表 2)中，82条序列被软件自动划分为2组，即洞头群体独立归为1组，其余群体为1组，测得组间的变异比例只有2.87%，同样表明组间分化程度很低，与Fst及AMOVA分析的结果相吻合。

表1 中国沿海前鳞群体的遗传多样性Tab.1 Genetic diversity statistics of Liza affinis in coastal waters of China

群体所处的地理位置Region of population数量Size变异位点数Variable site单倍型数量Nh单倍型多样性Hd核苷酸多样性π岱山 Daishan 10 2 5 0.2000±0.1540 0.0006±0.0004洞头 Dongtou 13 9 12 0.8080±0.1130 0.0021±0.0006平潭 Pingtan 23 8 10 0.5850±0.1220 0.0013±0.0004吴川,闸坡 Wuchua, Zhapo 10 3 6 0.3780±0.1810 0.0008±0.0005东兴 Dongxing 26 4 10 0.3510±0.1170 0.0005±0.0002东海 East China Sea 46 15 23 0.5790±0.0890 0.0014±0.0003南海 South China Sea 36 6 13 0.3540±0.1020 0.0006±0.0002总体 Total 82 18 32 0.4840±0.0700 0.0010±0.0002

图1 前鳞单倍型网络图Fig.1 Parsimony network of Liza affinis COIhaplotypes

2.2 前鳞的种群历史动态

中性检验的分析结果(表 3)如下：Tajima’sD方面，洞头、平潭、广东、东兴4个群体均为显著性负值，其余为非显著性负值。Fu’sFs方面，洞头、广东、东兴3个群体均呈显著性负值，总体也是显著性负值(FS=-20.3900，P=0)。Ramos-Onsins ＆ Rozas’sR2检验的分析显示(表 3)：R2的范围是 0.1610～0.1620(P<0.05)，SSD 值(0.0010～0.0220)和Rg值(0.0500～0.7200)均较小，且多数呈不显著性(P>0.05)，表明中国前鳞群体没有显著偏离扩张模型。此外，核苷酸错配图(图 2)呈现明显单峰、单倍型网络图(图 1)的星状结构与Fu’sFs的显著性负值均表明中国前鳞在近期经历过快速扩张，其扩张时间参数τ为0.6370，计算出中国前鳞种群扩张大约发生在13.4199～1.4911万年前，处于晚更新世时期(刘嘉麒等,1997)。

3 讨论

3.1 中国前鳞的遗传多样性

某物种的遗传多样性丰富与否和该物种所反映的单倍型多样性(Hd)及核苷酸多样性(π)密切相关(Boninet al, 2010)。该研究中，中国前鳞的遗传多样性(Hd=0.4840±0.0700，π=0.0010±0.0002)呈现出以洞头(Hd=0.8080±0.1130，π=0.0021±0.0006)为中心向南北逐渐减少的趋势，与许则滩(2015)报道的浙江前鳞遗传多样性由南向北递减的趋势相符。但该研究中洞头群体和岱山群体的遗传多样性有别于许则滩(2015)的研究结果(温州：Hd=0.6170±0.1350，π=0.0014±0.0004；岱山：Hd=0.3950±0.1280，π=0.0007±0.0003)，可能是由于二者分析的序列长度及群体中个体数量的不同而致[许则滩(2015)研究所采用的序列长度为623 bp，群体数量为温州16，岱山23]。与其他同样分布在日本南部及中国台湾海域等的鱼类基于COI序列的遗传多样性相比，中国前鳞的遗传多样性处于较低水平：鱼(Miichthys miiuy) (Hd=0.7310±0.0470,π=0.0028±0.0019) (Xuet al, 2014)，黄姑鱼 (Nibea albiflora) (Hd=0.6970±0.0023,π=0.0017±0.0002)(Changet al, 2016)，银鲳(Pampus argenteus)(Hd=0.8010,π=0.0040) (Xuet al, 2012)。此外，东海前

表2 前鳞 种群结构的分子方差分析及SAMOVA分析Tab.2 AMOVA and SAMOVA analysis of Liza affinis

表2 前鳞 种群结构的分子方差分析及SAMOVA分析Tab.2 AMOVA and SAMOVA analysis of Liza affinis

分析方法Method of analysis分组方式Method of grouping 分析参数Parameter of analysis群组间Among groups群组中群体间Among populations within groups群体内部Within populations总体Total AMOVA Group (5个群体5 populations)自由度 df 4.0000 77.0000 81.0000平方和 Sum of squares 1.4280 28.6450 30.0730变异组成 Variance components 0.0010 0.3720 0.3710 Group1(东海East China Sea)Group2 (南海South China Sea) 变异比例 Percentage of variation 0.4600 –0.5500 100.0900自由度 df 2.0000 2.0000 77.0000 81.0000平方和 Sum of squares 0.6640 0.7640 28.6450 30.0730变异组成 Variance components –0.0022 0.0007 0.3720 0.3704变异比例 Percentage of variation –0.2600 100.2600自由度 df 1.0000 3.0000 77.0000 81.0000平方和 Sum of squares 0.4000 1.0270 28.6450 30.0730变异组成 Variance components 0.0017 0.0021 0.3720 0.3717 SAMOVA Group1(洞头 Dongtou)Group2(其余4个群体Other 4 populations)Group1(东兴 Dongxing)Group2(吴川 Wuchua闸坡Zhapo) Group3(东海East China Sea) 变异比例 Percentage of variation –0.6000 0.1800 100.4100自由度 df 1.0000 3.0000 77.0000 81.0000平方和 Sum of squares 0.5430 0.8850 28.6450 30.0730变异组成 Variance components 0.0109 –0.0048 0.3720 0.3781变异比例 Percentage of variation 2.8700 –1.2600 98.3800

表3 前鳞的中性检验、核苷酸不配对分析Tab.3 Neutrality tests and mismatch analysis of Liza affinis

表3 前鳞的中性检验、核苷酸不配对分析Tab.3 Neutrality tests and mismatch analysis of Liza affinis

分析范围Range analysis群体所处的地理位置Region of population Tajima’s D值(P值)Fu’s Fs值(P值) R2值(P值) SSD值(P值) Rg值(P值)南海South China Sea 东兴 Dongxing –1.7070(0.0220) –3.4830(0.0000) 0.1610(0.0000)0.0030(0.3200) 0.1940(0.3800)总体 Total –2.3250(0.0000) –20.3900(0.0000)0.1620(0.0000) 0.0010(0.8600) 0.0840(0.8800)东海East China Sea 平潭 Pingtan –1.8480(0.0110) –6.5790(0.0000) 0.1620(0.0000) 0.0020(0.7500) 0.0500(0.9000)吴川, 闸坡Wuchua, Zhapo –1.5600(0.0400) –0.4590(0.1580) 0.1620(0.0000)0.0040(0.7000) 0.2220(0.7300)岱山 Daishan –1.4000(0.0880) 0.5860(0.4240) 0.1620(0.0000)0.0220(0.0180) 0.7200(0.7200)洞头 Dongtou –1.8670(0.0090) –4.7410(0.0010) 0.1620(0.0000)0.0070(0.6000) 0.0830(0.5900)

图 2 前鳞核苷酸错配分析图Fig.2 Nucleotide mismatch distribution of Liza affinis

3.2 前鳞鱼类的遗传结构和历史动态

该研究中 AMOVA分析所得的组间变异比例(–0.6%～0.46%)与许则滩(2015)对浙江沿岸前鳞的研究结果(0.25%)相似，均属极低水平。结合单倍型网络图、群体间Fst值及SAMOVA的分析结果，可知中国前鳞群体在各个地区、海域、海峡间无明显的遗传分化，推测该现象的形成可能与以下因素有关：1)频繁的基因交流。前鳞属洄游性鱼类，可在湖泊和江河索饵场洄游到海中产卵场进行繁殖(陆忠康,1985)，所产鱼卵主要漂浮在中国沿岸浅海处，随洋流漂流。已知冬季黑潮会把海洋有机物从菲律宾经东海送至中国大陆沿海，再结合中国南海的夏季暖流流向浙江近海，且目前暂无关于东海及南海的前鳞群体间在繁殖习性上存在差异的报道。故中国前鳞可能受到洄游产卵和海洋洋流的共同影响(Nakajimaet al,2014)，导致分布在不同地理位置的群体间有着频繁的基因交流，没有足够时间来积累遗传变异。2)近期种群扩张事件。中国前鳞的单倍型网络图、Tajima’sD和Fu’sFs中性检验、核苷酸错配分析等结果都表明中国前鳞整体在近期经历过种群的快速扩张，估算出其扩张大约发生在13.4199～1.4911万年前，处于晚更新世时期(刘嘉麒等, 1997)。这一时期，冰期中海平面的升降造成大部分近海鱼类都发生过种群的快速扩张(Niet al, 2014)，推测中国前鳞的快速扩张可能也与海平面的变化有关。在距今13.4199～1.4911万年的时间跨度中，北半球经历了2次冰期及1次间冰期(Stirlinget al, 1995; Winogradet al, 1997)，其交替过程如下：距今约13.4199～13.2000万年前，北半球处于冰期，而在13.2000～11.5000万年前，北半球处于末次间冰期，至11.5000～1.5000万年前，北半球处于末次冰期。冰期中的气温很低，中国大陆出现了大量冰原，中国沿海的海平面出现明显的下降(下降幅度最大可达150 m)，中国沿海大陆骨架大面积露出(Wang, 1999)，大大压缩了前鳞的生活空间。而末次间冰期是近15万年来全球最暖的时期，大陆的冰川开始消退，海平面逐渐上升，使前鳞的生活空间得以扩大，故前鳞较强的鱼卵扩散能力及活动能力伴随海侵导致种群发生快速扩张。资料显示，冰期中海平面下降时，孑遗的物种会集中于避难所中形成随机交配的祖先群体，故在冰期后经种群扩张至不同地理位置的群体间的遗传分化不明显(李双, 2015)。该研究中中国前鳞的扩张时间与之吻合，满足共同祖先假说。

3.3 中国前鳞的种质资源保护

鱼类作为水生生态系统的高级消费者，处于食物链的较高位置，是生态系统中物质循环、能量流动的重要参与者，与水生环境有着密切的联系，故各种水体污染和不适当的人类活动都可能对鱼类的生存产生不利的影响。而正常的生态系统功能的维持，需要制定相关的种质资源保护方案。仅就该研究中，中国前鳞没有形成明显的地理聚群，且各地理群体间的分化程度较低，可以将其视作一个进化显著单位。但各地区群体的遗传多样性差异较大，其中，洞头群体的遗传多样性(Hd=0.8080±0.1130,π=0.0021±0.0006)明显高于其他地理群体，建议优先对其进行保护。由于采样限制，该研究只涉及中国前鳞部分群体，且线粒体COI基因的进化速度不及线粒体控制区序列，不一定能如后者那样反映中国前鳞群体间可能存在的细微分化。另外，线粒体仅为母系遗传，也可能没有体现双亲遗传的核基因所能反映的遗传信息。因而在日后的工作中，需要结合测序控制区序列和基于核基因的多样性分析技术，补充更多地理群体，以全面了解中国前鳞的遗传背景及其基因流通道的分布，为种质资源的保护和开发利用提供科学依据。