基于系统药理学的麻黄细辛附子汤治疗缓慢型心律失常的作用机制研究＊

罗 蔚，郑景辉＊＊，徐文华，伍新诚，李建橡

（1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁532200；2.广西中医药大学研究生院，广西 南宁532200）

缓慢型心律失常（Bradycardia arrhythmia）又称为心动过缓，是心血管疾病的常见病证之一，主要包括窦性心动过缓、病态窦房结综合征、房室传导阻滞等[1]。长期缓慢型心律失常可出现心悸、心慌、胸闷、胸痛、乏力、晕厥等症状，甚至猝死。根据临床症状，缓慢型心律失常可归属于中医的“脉迟”、“心悸”、“怔忡”、“胸痹”、“厥证”等范畴[2]。麻黄细辛附子汤是《伤寒论》中治疗太阳、少阴两感证的高效名方，被广泛运用于缓慢型心律失常的治疗之中，并拥有良好的治疗效果[3-4]。系统药理学(Network pharmacology)作为以系统生物学理论为基础、探寻药物活性成分及靶点、对生物网络进行分析的新兴学科，强调通过信号通路的调节从而使药物的药效最大化[5-6]。本研究运用系统药理学方法对麻黄细辛附子汤治疗缓慢型心律失常的作用机制进行探究，以期为麻黄细辛附子汤药理作用机制的研究提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 材料

TCMSP数据库(中药系统药理学分析平台,http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)；TCMID数据库（中药信息综合数据库，http://www.megabionet.org/tcmid/）；Pharmmapper数据库（药效团匹配与潜在识别靶标平台,http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/submit_file.php）；OMIM数据库（人类基因和遗传数据库，http://www.omim.org/）；CTD数据库（比较毒物遗传数据库，http://ctd.mdibl.org,）；Genecards数据库（人类基因综合数据库，http://www.genecards.org/）；DAVID数据库（富集分析系统，https://david.ncifcrf.gov/home.jsp）；Draw Venn Diagram网站（韦恩图绘制网站，http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；String数据库（蛋白质互作数据库,https://string-db.org/cgi/input.pl）；KEGG数据库(http://www.genome.jp/kegg/)；Systemsdock数据库（系统分子对接数据库，http://systemsdock.unit.oist.jp/iddp/home/index）；PDB数据库（蛋白质结构数据库，https://www.rcsb.org/）；Cystoscope 3.6.1制图软件；Graphpad prism7.0绘图软件。

1.2 研究方法

1.2.1 麻黄细辛附子汤中药物成分的收集与筛选

将麻黄细辛附子汤中药物（麻黄、细辛、附子）名称代入TCMSP数据库及TCMID数据库，收集药物相对应的化学成分。口服利用度（OB）和类药性(DL)是决定药物分子是否具有较好的口服生物利用度以及成药性优劣的关键参数[7]，参考相关文献报道[8]后，本研究以OB≥30%且DL≥0.18为条件对收集到的药物化学成分进行二次筛选，得到相对高活性的化合物。

1.2.2 药物成分靶点的预测

将1.2.1中筛选得出的化合物统一保存为MOL2格式文件，上传至Pharmmapper平台，并设置条件为“药效团模型”，返回靶点数设置为TOP300，剔除非人源靶点，提交后由该平台完成药物成分靶点的预测，筛除重复部分后作为候选靶点[9]。

1.2.3 药物成分-靶点的网络构建与分析

STRING数据库作为一个储存已知的和预测的蛋白相互作用的数据库，可对蛋白之间直接或间接的相互作用进行评价。本研究将1.2.2中所得的候选靶点信息上传STRING10.5在线软件，限定研究物种为“Homo sapiens”，获得相应人源蛋白。并将从STRING数据库导出的文件中node1、node2和Combined score信息导入Cytoscape3.6.1软件构建药物成分-靶点网络，以探究麻黄细辛附子汤的药理学作用机制，其中“节点”（node）表示分子、靶蛋白，“边”（edge）表示成分与靶点之间的关系。

1.2.4 缓慢型心律失常相关靶点的获取

本研究以缓慢型心律失常（Bradycardia arrhythmia）及心动过缓（Bradycardia）为关键词，分别通过OMIM数据库、CTD数据库、Genecards数据库来搜索疾病相关靶点，选取每个数据库TOP400的靶点并筛除重复靶点。

1.2.5 麻黄细辛附子汤对缓慢型心律失常相关靶点的收集

将1.2.2中所获得的药物成分靶点与1.2.4中所收录的疾病靶点输入Draw Venn Diagram网站中以韦恩图形式进行交集比对,获取麻黄细辛附子汤作用于缓慢型心律失常的相关靶点。

1.2.6 靶点的富集分析

为了进一步阐明麻黄细辛附子汤治疗缓慢型心律失常的作用机制，本研究采用DAVID数据库对1.2.5中所获交集靶点进行GO（Gene Ontology）富集分析，包括生物过程（Biological Process，BP）、细胞成分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）分析，并采用KEGG数据库进行生物通路分析，探寻麻黄细辛附子汤作用于缓慢型心律失常的关键调控通路。

1.2.7 网络靶点特性分析

运用Cytoscape 3.6.1软件中插件Network Analyzer计算网络的拓扑参数。网络中节点之间如存在调控作用关系则以边相连。本研究基于平均最短路径、介数中心性、中心接近度、聚类系数、度值等参数评估节点在全网络中的关键性。

1.2.8 成分-靶点分子对接

为检测麻黄细辛附子汤治疗缓慢型心律失常的作用靶点是否具有较好的结合活性，本研究采用Systemsdock数据库进行成分-靶点分子对接。Systemsdock数据库是基于网络药理学的预测和分析的系统分子对接服务器，它应用高精度对接模拟和分子路径图来综合表征配体选择性[10]。首先登陆Systemsdock数据库，将麻黄细辛附子汤治疗缓慢型心律失常的潜在的14个作用靶点输入PDB ID一栏，找活性位点，计算格点，调整X-Y-Z坐标来细化位置。成功后开始对接，整理对接结果中的docking score并分析。

2 结果

2.1 麻黄细辛附子汤中的药物成分及相应靶点

以OB≥30%和DL≥0.18为条件下，通过TCMSP数据库TCMSP数据库及TCMID数据库共收集到麻黄23个成分、细辛8个成分、附子21个成分（结果见表1），其中编号MOL000422的化学成分异塔拉定为麻黄与细辛重复成分，保留唯一值后得到51个满足条件的药物成分。将该51个成分提交至Pharmmapper平台后获得靶点共707个，筛除重复部分后剩余263个靶点。

表1 麻黄细辛附子汤中的51个活性化合物基本信息

2.2 药物成分-靶点的网络构建与分析

采用网络图形化工具Cytoscape3.6.1软件将上述活性成分及预测靶点绘制出成分和作用靶点的关系网络（如图1），其中红色节点表示化合物，黄色节点表示药物靶点，每条边则表示化合物分子与靶点之间的相互作用关系。通过网络构建我们共获得297个节点和982个关系。其中，木犀草素、去甲乌头碱、儿茶酚、鲨烯等有效成分与网络中的多个靶点相互作用，而GPI、ETS1、UNC45A、MT-CYB等靶点亦能作用于多个有效成分。

图1 麻黄细辛附子汤化合物-靶点网络图

2.3 缓慢型心律失常相关靶点

以缓慢型心律失常（Bradycardia arrhythmia）及心动过缓（Bradycardia）为关键词，通过OMIM、CTD、Genecards数据库搜索出疾病相关靶点数量31326个。根据相关度每个数据库取前400个的靶点，去重复后保留566个缓慢型心律失常相关靶点。

2.4 麻黄细辛附子汤作用于缓慢型心律失常相关靶点的收集

将麻黄细辛附子汤中的成分靶点与缓慢型心律失常相关发病机制靶点进行交集比对，得出14个交集靶点（如图2），即该方剂中明确作用于缓慢型心律失常的靶点，分别是GSR、RAC1、SOD2、SOD1、EMD、MTOR、ADRA1B、F2、PTGS2、SNTA1、ADRB2、S100A8、CALM2、ACHE。

图2 麻黄细辛附子汤与缓慢型心律失常交集靶点韦恩图

2.5 麻黄细辛附子汤对缓慢型心律失常作用靶点的富集分析

经David数据库GO分析，共得出个63个生物学过程，主要包括对活性氧的反应、一氧化氮生物合成过程的调控、谷胱甘肽代谢、应激反应、血压调节、心肌收缩调节、心率调节、蛋白激酶活性调节、激活肾上腺素受体、炎症应答、细胞对ATP的反应、锌离子反应、超氧代谢过程、神经元调控等（图3列出排名前20的生物学过程）；细胞组成共10个，主要包括细胞外小体、溶酶体、质膜、细胞核、线粒体基质等（见图3）；分子功能共6项，包括：超氧化物歧化酶活性、硫酯酶结合、蛋白质同聚活性、蛋白激酶结合、蛋白结合、离子通道结合（见图3）；KEGG分析后发现11条通路，其中P值小于0.05值的有5条（见表2），它们分别是：唾腺分泌、心肌细胞的肾上腺素能、cGMP-pkg信号通路、钙信号通路、cAMP信号通路。

图3 GO分析结果

2.5 麻黄细辛附子汤蛋白互作网络的拓扑学分析

经Network Analyzer分析，麻黄细辛附子汤的蛋白互作拓扑学分析结果见表3，经网络拓扑学属性发现，该PPI网络中平均最短路径在2.301～2.815，平均介数中心性在0.049～0.324，平均中心接近度0.3949，平均聚类系数为0.301，网络中节点的度值曲线、介数中心性曲线接近于幂律分布这些蛋白也是该方发挥治疗作用的关键分子基础，并在关系网络中体现了较好的连通特性。

表2 麻黄细辛附子汤对缓慢型心律失常作用靶点的信号通路

表3 麻黄细辛附子汤蛋白互作拓扑学分析（按连通度排序取前十个）

2.5 麻黄细辛附子汤对缓慢型心律失常作用靶点分子对接结果

麻黄细辛附子汤对缓慢型心律失常的作用靶点分子对接结果如表4所示。一般认为系统对接分值大于4.25表示对接分子与靶点之间有一定的结合活性，大于5.0表明对接分子与靶点之间有较好的结合活性，大于7.0则说明具有强烈的结合活性[11]。本次分子对接结果显示：MTOR、SOD2、F2、SNTA1、CALM2、PTGS2、ADRB2、ACHEGSR、RAC1、EMD等11个作用靶点的系统对接分值均大于5.0，说明麻黄细辛附子汤与缓慢型心律失常预测的作用靶点有较好的结合活性。

表4 麻黄细辛附子汤对作用靶点分子对接结果

3 讨论

缓慢性心律失常以心动过缓为特征,资料显示,老年冠心病患者最易发生缓慢性心律失常,24小时动态心电图检出率高达75%[12]。随着我国人口的老龄化,缓慢型心律失常的危害也将进一步加重。在缓慢性心律失常的治疗方面，西医以抗胆碱能药物、异丙肾上腺素等药物以及安装起搏器为主要治疗手段，但长期的药物治疗不良反应较大，介入治疗则费用昂贵，依从性相对较差[13]。而中医药在缓慢心律失常的治疗上安全性较高，价格便宜，且疗效良好，相对西医更有优势[14-15]。麻黄细辛附子汤是《伤寒论》中治疗太阳、少阴两感证的高效名方，解表散寒的同时具有扶助阳气、温肾强心的功效，是治疗缓慢型心律失常的常用方之一。系统药理学以系统生物学理论为基础、探寻药物活性成分及靶点、对生物网络进行分析，强调通过信号通路的调节从而使药物的药效最大化，这与中药方剂多重靶点、多途径和多成分的特点不谋而合，这也是系统药理学尤为适用于中药复方治疗疾病的作用机制研究的原因。

为了探究麻黄细辛附子汤治疗缓慢型心律失常的作用机制，本研究先利用TCMSP中药系统药理学分析平台和PharmMapper数据库研究了麻黄细辛附子汤3味中药(麻黄、细辛、附子)的有效成分及其作用靶点，通过构建化合物-靶点网络分析了化合物与靶点直接的相互作用关系。结果显示：木犀草素、去甲乌头碱、儿茶酚、鲨烯等有效成分与多个靶点相互作用，说明它们是麻黄细辛附子汤中的多效活性化合物；GPI、ETS1、UNC45A、MT-CYB等靶点能作用于多个有效成分，是化合物-靶点网络的关键靶点。

这些成分靶点与通过基因数据库确定下来的566个缓慢型心律失常相关疾病靶点共有14个交集靶点，可推断这14个交集靶点是麻黄细辛附子汤作用于缓慢型心律失常的预测靶点。对预测靶点的GO功能分析结果显示，麻黄细辛附子汤治疗缓慢型心律失常的生物过程主要体现在对活性氧的反应、一氧化氮生物合成过程的调控、谷胱甘肽代谢、应激反应、血压调节、心肌收缩调节等方面。活性氧在中枢和外周都对心血管系统有重要的影响,中枢活性氧可介导交感兴奋所致的心率、血压等心血管效应。于海云等人[16]在对活性氧对中枢心血管效应的影响时发现：血清中活性氧含量的减少可以引起血压的下降和心率的减缓。此外，有动物实验研究表明，通过提高心肌组织匀浆中一氧化氮含量可以使实验大鼠的心率,防止缓慢性心律失常进一步恶化[17]。谷胱甘肽代谢、应激反应、血压调节、心肌收缩调节等也都与心率变异性密切相关[18-20]。细胞组成主要体现在细胞外小体、溶酶体、质膜、细胞核等。有学者[21]曾提出，溶酶体通过对心肌及心肌细胞的电重构产生影响，从而参与心律失常的发生、发展。Bkaily等[22]报道指出,细胞核及核上受体在心肌细胞电生理稳态的维持及兴奋-收缩偶联过程中起重要作用,通过直接或间接地影响离子转运，这也是心律失常的重要基础。麻黄细辛附子汤治疗缓慢型心律失常的分子功能则主要体现在超氧化物歧化酶活性、硫酯酶结合、蛋白质同聚活性、蛋白激酶结合等。

在本次研究的KEGG生物途径富集分析中，共得到5条P值小于0.05值的信号通路，分别为：唾腺分泌、心肌细胞的肾上腺素能、cGMP-pkg信号通路、钙信号通路、cAMP信号通路。既往有研究表明，肾上腺素有兴奋α受体、β受体的作用，从而发挥升高血压、促进心肌收缩、加快心率、增强心室及房室传导速度的作用[23-24]。广泛存在于真核细胞内的蛋白激酶(PKG)是环磷酸鸟苷(cGMP)最重要的下游靶点和主要依赖的蛋白酶之一，可松弛血管平滑肌、扩张血管、维持心律平稳。Han等[25]通过实验发现cGMP的含量的增加可而激活PKG,从而达到保护心肌细胞以及降低心律失常发病率的作用。Brunner等[26]在比较野生型小鼠和转基因小鼠eNOS的表达和钙离子浓度的实验中也发现cGMP含量的增加对心肌细胞具有保护作用。钙离子在体内有着重要作用,心律失常与心肌细胞内钙稳态有重要联系，核受体通过心肌细胞内离子通道及信号通路对胞内钙变化的影响是直接导致心律失常的重要原因之一。赵灿等［27］通过研究发现，心肌肌钙蛋白在被cAMP活化的蛋白激酶作用下磷酸化,磷酸化后的肌钙蛋白可与钙离子结合,增加心肌收缩力。刘周英等人[28]通过对比实验发现,适当降低心肌细胞上的钙电流表达能有效治疗心动过缓,并改善心肌细胞的功能。本次研究中麻黄细辛附子汤治疗缓慢型心律失常的KEGG分析结果亦包含有钙信号通路，这说明：钙信号具有成为缓慢型心律失常治疗靶点的潜质。此外，cAMP的活化蛋白激酶还能通过糖原分解的促进作用,增加心肌能量供应从而增强心肌的收缩力，改善心动过缓。以上环节在本次研究中所得出的通路中均有反映，可以推测，麻黄细辛附子汤正是通过多种活效成分作用于这些显著性富集的通路从而达到治疗缓慢型心律失常的目的。值得注意的是，本次研究中所发现的麻黄细辛附子汤对唾腺分泌这一通路的调控作用在以往研究中尚未见报道，这值得我们在未来科研活动中继续探入探究。

系统分子对接结果显示，麻黄细辛附子汤对缓慢型心律失常作用靶点分子具有良好的结合活性，也说明麻黄细辛附子汤的活性成分可以与受体蛋白稳定结合并发挥作用。在11个结合活性良好的作用靶点里，MTOR的系统对接分值最高，即结合性最好。既往有研究表明，干预MTOR表达可以调控心肌细胞Bcl-2,Bax蛋白表达水平，从而减少心肌细胞凋亡,加强心肌收缩力、改善心功能[29]。此外，田振军等人[30]通过实验发现，激活MTOR信号通路可以促进心梗大鼠心肌细胞增殖、降低心肌纤维化面积和改善心功能中发挥重要作用。分子对接的结果也进一步为麻黄细辛附子汤治疗缓慢型心律失常提供了新的思路。

综上所述，本研究通过系统药理学方法得出了麻黄细辛附子汤作用于缓慢型心律失常可能的潜在靶点，探究了麻黄细辛附子汤在治疗缓慢型心律失常中的作用机制，为进一步理解药物有效成分-靶点-疾病相互作用机制提供了重要信息，也为中医药治疗缓慢型心律失常的机制研究提供了新思路。