微波预处理对热诱导小麦面筋蛋白凝胶性质和微观结构的影响

陆 毅 穆冬冬 罗水忠 赵妍嫣 钟昔阳 姜绍通 郑 志

(合肥工业大学食品科学与工程学院;安徽省农产品精深加工重点实验室，合肥 230009)

小麦面筋蛋白又称谷朊粉，是小麦淀粉加工过程副产物，蛋白质质量分数为72%～85%，氨基酸组成丰富[1]。小麦面筋蛋白作为一种优质的蛋白质资源，被广泛应用于食品、饲料等领域。由于小麦面筋蛋白具有良好的延展性、黏弹性、乳化性和吸水性等功能性质，可被用于制作可食性、易降解薄膜[2]、添加到化妆品[3]、宠物饲料中[4]，又由于其良好的凝胶特性，常被作为添加剂加入到面包等烘焙制品、肉丸等肉制品中来改善产品的感官特性和质构。

蛋白质胶凝作用是变性蛋白质分子聚集而形成有序的蛋白质网络结构的过程。热诱导凝胶是指蛋白质受热变性，蛋白质结构发生一定程度的展开，变性后的蛋白质聚集形成大分子的聚集体，最终产生强度较高且富有弹性的凝胶[5]。但是小麦面筋蛋白紧密的分子结构和较差的亲水性限制了其凝胶性能的提高和稳定。提高蛋白质凝胶性的方法主要包括：物理、化学、酶及复合改性等。物理方法由于其操作的简便性和安全性引起了许多研究者注意。微波处理作为一种物理改性方法，通过热能量的变化来改变蛋白质的高级结构和分子间的聚集方式，从而改善蛋白质的功能特性，成为近年研究热点[6]。Liu等[7]研究发现，相比单纯的水浴加热制备热诱导大豆分离蛋白凝胶，微波预处理显著提高了热诱导大豆分离蛋白凝胶的弹性模量，并且微观结构呈现更为致密的蜂窝状。Qin等[8]在微波预处理对谷氨酰胺转氨酶(TG酶)促大豆蛋白与小麦面筋蛋白混合凝胶特性影响的研究中发现，一定程度的微波预处理导致了蛋白分子结构的松散，促进了TG酶的交联效率，使其形成了更为致密的凝胶网络结构，从而显著提高了混合蛋白凝胶的弹性模量、凝胶强度和持水性等性质。

本研究拟通过分析微波预处理下热诱导小麦面筋蛋白凝胶的强度、持水性、水分分布、表面疏水性、分子间作用力和微观结构的变化，探究微波预处理对热诱导小麦面筋蛋白凝胶性质的影响，为改善小麦面筋蛋白凝胶的性质及其应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦面筋蛋白：安徽瑞福祥食品有限公司；考马斯亮蓝G250；8-苯胺-1-萘磺酸：北京索莱宝科技有限公司；牛血清蛋白：上海缘聚生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WP700TL23-K1型微波仪，格兰仕微波炉电器有限公司；CR22GⅡ型冷冻离心机，日本HITACHI公司；TA-XT2i型质构仪、Q200-2156型差示扫描量热仪(DSC)，美国TA仪器公司；FD-1B-50型冷冻干燥机，北京博医康仪器有限公司；MX-S涡旋混合器，美国Scilogex公司；MultiskanTMFC型全波长酶标仪，Thermo Fisher Scientific公司；721G型分光光度计，上海精科仪器有限公司；JSM-6490LV型扫描电子显微镜(SEM)，日本电子公司。

1.3 小麦面筋蛋白的微波预处理和热诱导小麦面筋蛋白凝胶的制备

参考Wang[9]等的方法略做修改，蒸馏水配制25 mL、16%小麦面筋蛋白悬浮液，将制备好的悬浮液置于带有功率和时间控制器的微波仪中，分别在70、210、350、490、700 W微波功率，90 s微波处理时间；10、30、50、70、90 s微波处理时间，700 W微波功率的条件下处理悬浮液。将悬浮液95 ℃水浴加热40 min，冰水浴冷却30 min，获得热诱导凝胶置于4 ℃冰箱待测。为防止水蒸气破坏凝胶结构，采用间歇式加热，每加热20 s停顿10 s。以未经微波预处理的小麦面筋蛋白悬浮液经过单纯的热诱导小麦面筋蛋白凝胶作为对照组。

1.4 检测方法

1.4.1 凝胶强度的测定

参考孙撬撬等[10]的方法，取1.3制备的热诱导小麦面筋蛋白凝胶，采用质构仪测定样品凝胶强度。

1.4.2 持水性的测定

参考梁婧等[11]的方法，略作修改。取3 g(记作Wt)1.3制备的凝胶样品于4 ℃，8 000 r/min条件下离心15 min。将离心后的样品转移到滤纸上除去水分，再次称重(记作Wr)。持水性计算公式：

式中：Wt为离心前凝胶样品的质量；Wr为离心并除去溢出的水分后凝胶的质量。

1.4.3 水分分布的测定

根据王飞镝等[12]的方法略作修改，取3～5 mg凝胶样品于铝盘中压盘，以空盘为对照组。将样品置于Q200示差量热扫描仪中，以5 ℃/min的速度从-60 ℃升温到50 ℃，氮气流速50 mL/min。计算公式：

凝胶样品中非冻结水含量：Wnf=Wt-Wf

式中：Wt为凝胶总含水量；Wf为凝胶中可冻结水含量；ΔH为凝胶中水的热焓值/J/g；ΔH0为纯水的热焓值，334 J/g。

1.4.4 表面疏水性的测定

小麦面筋蛋白凝胶的表面疏水性H0参考Wang等[13]的方法测定。取0.1 g冷冻干燥后的凝胶样品溶于0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0，15 mL)，8 000 r/min离心15 min后取上清液，上清液蛋白浓度由考马斯亮蓝法测得。将上清液分别稀释为0.15、0.075、0.038、0.019 mg/mL。取3 mL上清液，加入30μl ANS后测量荧光强度(激发波长：365 nm，发射波长：484 nm)。H0为荧光强度相对蛋白质浓度的初始斜率值。

1.4.5 分子间作用力的测定

根据Cao等[14]的方法稍作修改。用于溶解热诱导小麦面筋蛋白凝胶样品的四种磷酸盐缓冲溶液如下：0.05 moL/L NaCl (PA)；0.6 moL/L NaCl (PB)；0.6 moL/L NaCl+1.5 moL/L尿素 (PC)；0.6 moL/L NaCl+8 moL/L尿素 (PD)。取0.3 g冷冻干燥的凝胶样品，分别溶于5 mL四种磷酸盐缓冲溶液中。4 ℃条件下静置1 h后，8 000 r/min离心20 min取上清液，以考马斯亮蓝法测上清液蛋白浓度。溶解于PB和PA中的小麦面筋蛋白含量之差代表离子键的贡献，溶解于PC和PB中的小麦面筋蛋白含量之差代表氢键的贡献，溶解于PD和PC中的小麦面筋蛋白含量之差代表疏水相互作用的贡献。

1.4.6 微观结构的观察

参考谢新华等[15]的方法，采用扫描电子显微镜观察热诱导小麦面筋蛋白凝胶的微观结构。

1.5 数据处理与分析

本研究中每个试验重复三次，结果采用平均值±标准差的形式表示。采用SPASS软件分析数据的显著性(P<0.05)，采用Origin8.0软件制作图片。

2 结果与分析

2.1 热诱导小麦面筋蛋白凝胶强度的分析

凝胶强度是热诱导小麦面筋蛋白凝胶性质的一个重要指标。热诱导小麦面筋蛋白凝胶强度的变化如图1所示。

由图1可知，随着微波功率的增大，凝胶强度呈现出先减小后增大的趋势。700 W微波功率时凝胶强度达到158.6 g/cm2，显著高于对照组的凝胶强度。微波时间对凝胶强度的影响也表现出相似的趋势。叶阳等[16]在微波预处理对鸡蛋清蛋白凝胶强度影响的研究中得到了类似的结果，认为凝胶强度的增大是由于微波预处理使得小麦面筋蛋白结构松散，导致埋藏在分子内部的疏水性基团的暴露，进而增强了凝胶形成过程中蛋白分子间的疏水相互作用，促进了更为稳定的蛋白凝胶的形成。

图1 微波预处理对小麦面筋蛋白凝胶强度的影响

2.2 热诱导小麦面筋蛋白凝胶持水性的分析

小麦面筋蛋白凝胶持水性反映了凝胶截留水分的能力，热诱导小麦面筋蛋白凝胶持水性的变化情况如图2所示。

图2 微波预处理对小麦面筋蛋白凝胶持水性的影响

由图2可知，当微波时间为90 s时，随着微波功率的增加，凝胶持水性略微降低，在210 W时降至29.26%，随着功率的进一步增加，凝胶持水性显著增加。在700 W功率条件下，热诱导小麦面筋蛋白凝胶持水性的变化表现出逐渐增大的趋势。在700 W，90 s条件下，持水性达到83.13%。结果表明了一定程度的微波预处理能够促进蛋白质-水之间的相互作用，使得更多的水分保留。李秋慧等[17]在微波处理对大豆-磷脂混合凝胶体系影响的研究中也得到了类似的结果，发现随着微波功率的增加，复合凝胶体系的WHC呈现逐渐增大的趋势。可能的原因是一定程度的微波预处理改变了蛋白质分子的构象，促进了更为致密均匀的凝胶网络的形成，致密、均匀的凝胶网络能够将更多的水分束缚在凝胶体系中，从而增强了凝胶的持水能力。

2.3 热诱导小麦面筋蛋白凝胶中水分分布的分析

通过热分析法(DSC)研究小麦面筋蛋白凝胶体系中水分的分布，热诱导小麦面筋蛋白凝胶体系中水分分布的变化如图3所示。

图3 微波处理对小麦面筋蛋白凝胶水分分布的影响

凝胶体系中水分分布是凝胶性质的重要影响因素，其中蛋白质-水之间相互作用对维持凝胶三维网络结构具有重要作用[18],由图3可知，热诱导小麦面筋蛋白凝胶体系中总含水量的变化不显著，而当微波功率和微波时间增大时，体系中的非冻结水含量呈现出显著增大的趋势。在微波功率700 W，微波时间90 s条件下，非冻结水含量达到25.20%。因此认为一定条件下的微波预处理能够有效增强小麦面筋蛋白与水分子间的相互作用。“三态水”理论认为，凝胶体系中的水分为非冻结水和冻结水两大类[19]。Hayashi等[20]采用DSC，通过测定可冻结水含量分析了大豆分离蛋白中的水分分布情况，发现非冻结水与蛋白质分子紧密连接在一起。Chen[21]等的研究表明，水分子与蛋白质分子以非冻结水的形式紧密结合是导致体系具有较高持水性能的重要因素之一。

2.4 热诱导小麦面筋蛋白凝胶表面疏水性的分析

表面疏水性反映了蛋白质表面疏水性基团的数量，对极性条件下的蛋白质的稳定性、构象中起着重要作用，对表面疏水性的分析能够用来反映蛋白质构象的变化[18]。热诱导小麦面筋蛋白凝胶表面疏水性的变化如图4所示。

图4 微波预处理对小麦面筋蛋白凝胶表面疏水性的影响

当微波时间为90 s时，微波功率在70 W的条件下相比对照组的表面疏水性增加，而随着微波功率从70 W增加到700 W时，表面疏水性逐渐降低。当微波功率700 W时，微波时间在10 s的条件下表面疏水性相比对照组的表面疏水性有所增强，而随着微波时间的增加，表面疏水性逐渐降低至62.73。蔡建荣等[22]认为微波能够诱导蛋白分子产生空间极化现象，破坏维持蛋白质空间结构的非共价键，使其部分展开，导致疏水性基团暴露，表面疏水性增加。随着微波功率和时间的增加，极化的蛋白质之间通过疏水相互作用，静电相互作用、氢键等非共价键使小麦面筋蛋白发生聚集，疏水基团被重新埋藏起来，表面疏水性减弱。

2.5 热诱导小麦面筋蛋白凝胶分子间作用力的分析

离子键、氢键、疏水相互作用等化学键是维持小麦蛋白凝胶结构的主要作用力。根据不同化学试剂能够破坏小麦面筋蛋白凝胶特定的化学键，测定热诱导小麦面筋蛋白凝胶中分子间作用力的变化。

图5 微波处理对小麦面筋蛋白凝胶分子间作用力的影响

如图5所示，微波预处理后，氢键的贡献相比对照组表现出了明显的降低，这可能是由于微波热效应破坏了部分维持蛋白质结构的氢键，而在冷却阶段形成的氢键较少[9]。在微波功率210 W，处理时间90 s和微波功率700 W，处理时间30 s时，凝胶中疏水相互作用的贡献分别为0.65 g/L和0.78 g/L，显著低于对照组的0.85 g/L。随着微波作用的加强，疏水相互作用增加至1.69 g/L。有研究报道[15, 23-24]，在蛋白凝胶形成过程中疏水相互作用是维持蛋白质凝胶结构的主要作用力之一，而增强的作用力有利于凝胶形成致密、稳定的网络结构。

2.6 热诱导小麦面筋蛋白微观结构的分析

SEM的测定评估了微波预处理对小麦面筋蛋白凝胶三维网络结构的影响。热诱导小麦面筋蛋白凝胶微观结构的变化如图6所示。

注：a:对照组；b、c、d、e、f、:微波功率700 W，微波时间10、30、50、70、90 s预处理后小麦面筋蛋白凝胶。图6 微波预处理对小麦面筋蛋白凝胶微观结构的影响

由图6可知，对照组的微观网络结构呈圆孔网络状，孔隙较大且粗糙。而经过微波预处理的热诱导小麦面筋蛋白凝胶则具有更为致密、平滑和均匀的三维网络结构。Ji等[25]在微波预处理对鳕鱼鱼糜-魔芋胶混合凝胶性质影响的研究中发现，鳕鱼鱼糜和魔芋胶经过微波预处理后形成了网络结构更为致密、均匀的混合凝胶。凝胶的三维网络结构是其持水性等凝胶性质的重要影响因素。Chen[26]等的研究认为致密均匀的网络结构能够将水分更好的束缚在凝胶体系中，进而改善其持水性等凝胶性质。因此可以认为适当的微波预处理能够有效改善热诱导小麦面筋蛋白凝胶的三维网络结构。

3 结论

微波预处理通过诱导小麦面筋蛋白发生空间极化现象及分子结构的部分展开，能够显著增大热诱导小麦面筋蛋白凝胶的凝胶强度和持水性，分别比对照组提高83.4%和162%，表面疏水性降低至62.73；当微波功率为700 W，微波时间90 s时，疏水相互作用贡献增加，并促使了孔隙更为致密、均匀的热诱导小麦面筋蛋白凝胶三维网络的形成。因此可认为微波预处理能够有效地改善热诱导小麦面筋蛋白凝胶的性质和微观结构，可以为改善小麦面筋蛋白凝胶的性质及其在食品工业的应用提供新思路。