球型脂联素通过TGFβ1/Smads通路对2型糖尿病大鼠肾病保护作用的探讨

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近年来，糖尿病(DM)患病率迅速增加。最新数据显示，中国成年人DM患病率高达10.9%，DM前期患病率为35.7%[1]。糖尿病肾病(DN)是DM最严重的并发症和导致终末期肾病(ESRD)的主要原因之一[2]。转化生长因子-β1(TGF-β1)被认为是肾脏纤维化的关键介质，Smad依赖性信号通路是TGF-β1诱导纤维化的经典通路[3]，与DN发生发展密切相关。近年研究发现，脂联素(ADPN)可能具有抑制肾脏纤维化作用，但机制尚不完全清楚[4-5]。本研究观察了球型脂联素(gAd)对2型糖尿病大鼠肾脏病变TGF-β1/Smads通路的影响，旨在探讨gAd对糖尿病肾脏病变的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 清洁级4周龄体重(180～200) g的健康SD雄性大鼠60只(山西医科大学动物实验中心)；高糖高脂饲料(北京科澳协力饲料有限公司)；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)；gAd(美国BioVision公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 造模及分组 60只SD大鼠适应性喂养1周，随机分为NC组(18只)、造模组(42只)。NC组喂养普通饲料，造模组喂养高糖高脂饲料。12周后大鼠平均体重达500 g，禁食12 h，给予造模组空腹一次性腹腔内注射1% STZ 30 mg/kg，NC组腹腔内注射等量缓冲液，72 h后尾静脉取血测血糖≥16.7 mmol/L，同时出现DM症状，即2型糖尿病大鼠模型成功建立。继续喂养6周检测造模组大鼠尿蛋白阳性，肾脏病理示肾小球系膜细胞增生、基膜增厚，肾小球体积明显增大，同时肾小管管腔变窄，表明2型糖尿病大鼠肾脏病变模型成功建立。最终成模36只，随机分为DM组(18只)、AD组(18只)。AD组给予gAd腹腔缓慢注射10 μg/(kg·d)，余两组予等量生理盐水。

1.2.2 标本采集 于观察4周、8周、12周末各组随机取6只大鼠，收集24 h尿液，测24 h尿蛋白、尿肌酐。大鼠称重，麻醉后从腹主动脉采血，离心取血清，于-80 ℃保存备测；处死大鼠，切取左肾去被膜后长轴对切，称重，滤纸吸干表面血液及水分，取部分用10%中性甲醛固定后石蜡包埋，剩余部分液氮冻透后-80 ℃冻存备用。

1.2.3 肾脏病理改变 10%中性甲醛固定肾组织，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋切片，厚3 μm，HE 染色，光镜下观察肾组织形态学。

1.2.4 免疫组化 采用SABC 法测肾组织TGF-β1、Smad3、Smad7水平。图像分析采用Scanscope 数字扫描系统，每张随机选5 个不同镜下视野内各指标的平均积分光密度，以棕黄色颗粒为阳性，阳性表达与灰度值成反比。

1.2.5 Real Time-PCR法 测定肾组织TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表达。取各组肾脏组织50 mg提总RNA，反转录行Real Time-PCR扩增： 94 ℃预变性10 min，然后94℃变性15 s，60 ℃复性60 s，共45循环。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.6 Western blot法 测肾组织TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表达。提取蛋白样本，转膜，封闭，1∶1 000稀释鼠源 TGF-β1、Smad3、Smad7抗体(美国Cell Signaling公司)4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育 2 h，ECL底物化学发光显色、显影、定影、扫描。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况 DM 组较同期NC组大鼠空腹血糖(FBG)、24 h尿蛋白、尿肌酐、肾重/体重升高，AD组较同期DM组上述指标降低(P<0.05)。详见表2 。

表2 各组大鼠一般特征比较比较(±s)

2.2 肾脏组织形态学改变 光镜下，NC组肾脏结构清晰。DM组肾脏结构较NC组紊乱，肾小球肥大，内皮细胞紊乱，系膜细胞肿胀，系膜基质明显增多，系膜区显著扩大，肾小管细胞增生肥大，管腔变窄且可见空泡样变。4周时上述改变即出现，8周、12周逐渐加重。AD组较DM组肾脏结构损害明显减轻。详见图1。

图1 光镜下各组大鼠肾脏形态学变化(HE染色×200)

2.3 各组大鼠肾脏组织TGF-β1、Smad3、Smad7免疫组化改变 NC组大鼠肾小球、肾小管低TGF-β1、Smad3表达，Smad7高表达；然而，与NC组比，DM 组大鼠TGF-β1、Smad3表达明显增加，Smad7表达明显降低(P<0.05)；与DM组比，AD组TGF-β1、Smad3表达减少，Smad7表达增加(P<0.05)。详见表3、图2～图4。

表3 各组大鼠肾脏 Smad3、Smad7、TGF-β1免疫组化灰度值比较(±s)

图2 免疫组化示各组大鼠肾脏Smad3表达(×200)

图3 免疫组化示各组大鼠肾脏Smad7表达(×200)

图4免疫组化示各组大鼠肾脏TGF-β1表达(×200)

2.4 各组大鼠肾脏组织TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA表达的变化 与同期NC组比，DM组大鼠肾脏组织TGF-β1、Smad3 mRNA表达增加，Smad7 mRNA表达减少(P<0.05)；AD组TGF-β1、Smad3 mRNA表达较DM组减少，Smad7 mRNA表达较DM组增加(P<0.05)，且于8周、12周时接近NC组水平。详见表4。

表4 各组大鼠肾脏Smad3 mRNA、Smad7 mRNA、TGF-β1mRNA表达比较(±s)

2.5 各组大鼠肾脏组织TGF-β1、Smad3、Smad7蛋白表达的变化 各时间段中，DM组TGF-β1、Smad3蛋白水平较NC组增加(P<0.05)，AD组TGF-β1、Smad3蛋白水平较DM组减低(P<0.05)；相反，DM组Smad7蛋白水平较NC组减低(P<0.05)，而AD组Smad7蛋白水平较DM组增加(P<0.05)；上述指标于8周、12周时，AD组与同期NC组间表达无统计学意义。详见表5、图5。

表5 各组大鼠肾脏Smad3、Smad7、TGF-β1蛋白表达的比较(±s)

图5 Western blot 检测各组大鼠肾脏Smad3、Smad7、 TGF-β1蛋白表达

3 讨 论

DN是DM最严重的并发症之一，其病理变化主要表现为间质纤维化、肾小球硬化及肾小管萎缩[6]。肾纤维化是各种病因引起慢性肾脏疾病进展到ESRD的共同通路[7]。

TGF-β1是肾纤维化过程中重要的细胞因子[8-11]。Smad依赖性信号通路是TGF-β1诱导纤维化的最经典的信号通路[3]。Smads家族包含9种 Smad 蛋白，分三大亚型，依次是膜受体激活型 Smad(R-Smad)、通用型Smad(Co-Smad)和抑制型Smad(I-Smad)。Smad3为R-Smad的一种，当TGF-β与其位于胞膜的受体结合后，Smad3发生磷酸化，进而与Smad4(Co-Smad)形成复合物进入核内调节靶基因转录[12-13]。而Smad7为I-Smad，可竞争性地抑制R-Smad与受体结合，是TGF-β1信号通路的抑制因子。Smad3在高糖时被激活，而Smad7通过泛素-蛋白酶体降解机制被降解[14]。本实验从组织病理、mRNA及蛋白水平均说明，DM组TGF-β1、Smad3表达升高，而Smad7表达降低，且平行于肾脏纤维化程度。提示TGF-β1、Smad3在2型糖尿病肾脏病变肾脏纤维化中起致病作用，Smad7起保护作用。

ADPN是主要由脂肪细胞分泌的脂肪因子[15]，由244个氨基酸组成，与胶原蛋白和TNF-α结构相似[16]，其中gAd是ADPN实现生物效应的主要区域。ADPN具有增加胰岛素敏感性、抗炎及血管保护作用[17]。多项研究表明，ADPN亦可通过减少糖代谢终末产物，增强超氧化物歧化酶(SOD)活力，保护血管内皮、减轻活性氧的损害等方面发挥抗肾脏纤维化作用[18-20]。本实验发现，不同时间段，DM 组较相应NC组大鼠FBG、24 h尿白蛋白、尿肌酐、肾重/体重明显升高，肾脏结构紊乱。AD组较同期DM组上述指标明显降低，肾脏结构损害减轻。AD组较同期DM组TGF-β1、Smad3表达减少，Smad7表达增加。说明gAd可通过TGF-β1/Smads通路，延缓糖尿病肾脏病变肾纤维化的进展。gAd干预4周时即可上调Smad7表达，同时下调TGF-β1、Smad3的表达，使TGF-β1、Smad3、Smad7的水平在gAd干预达8周、12周时与NC组无统计学意义，说明在gAd干预的早期(4周)即可表现出其对糖尿病肾脏病变的保护作用，随着gAd作用时间的延长，这种保护作用更加明显。

综上所述，gAd可通过抑制TGF-β1/Smads，下调Smad3表达，同时上调Smad7表达，延缓2型糖尿病肾病肾脏纤维化的进展。