线粒体功能异常与卵巢衰老关系的研究进展

杨慧 孙若芸 马瑞红 夏天 高慧

线粒体是颗粒细胞内含量最丰富的细胞器，卵母细胞线粒体是卵母细胞质中含量最为丰富的细胞器，若线粒体功能下降可能会影响卵母细胞质量，进而导致卵母细胞的老化，甚至卵巢衰老[1]。目前研究认为，卵巢衰老的分子生物学机制主要包括 DNA损伤修复[2]、端粒缩短[3]、代谢紊乱和线粒体功能异常。本文对线粒体与卵巢衰老相关文献进行综述，以了解线粒体与卵巢衰老之间的关系，为临床上提高卵巢衰老有关的不孕症治疗的妊娠率提供理论依据。

一、线粒体功能

在真核细胞中，线粒体是唯一含有DNA的细胞器。电镜显示线粒体由内外双层膜封闭环绕成杆形或颗粒形，内膜向线粒体基质皱褶形成嵴。基质中存在参与三羧酸循环的酶类，并且含有Ca2+、Mg2+等离子。线粒体DNA(mitochondrial DNA,mt DNA)多存在线粒体嵴上，并呈双链环状致密结构，基因组全序列长度为16.6 kb，共编码37种基因，每个线粒体内有2～10个mt DNA 拷贝数。卵母细胞内含有2种基因组，即核DNA(nuclear DNA,n DNA)和mt DNA，而线粒体功能需要的大部分蛋白质由核基因编码，由n DNA和mt DNA共同调控完成[4]。卵母细胞中线粒体及mt DNA是最多的。线粒体在机体内不仅作为能量工厂为细胞供能，为细胞活动提供几乎全部的能量来源，还具有维持细胞内的钙离子的稳态、参与细胞凋亡过程、合成嘧啶和血红素等重要的生理功能。故目前认为，线粒体主要有以下4个功能：(1)产生ATP；(2)产生活性氧(reactive oxygen species，ROS)；(3)参与细胞凋亡途径；(4)维持钙离子平衡。

二、线粒体与卵巢衰老

1.线粒体数量与卵巢衰老

年龄是影响卵母细胞质量的重要原因之一[5]。而细胞内线粒体的数量会随着年龄的增长而发生变化。女性随着年龄的增长，机体的抗氧化能力逐渐降低，细胞内的氧自由基减少，ROS堆积，卵母细胞线粒体长期暴露在ROS堆积的环境中，线粒体出现基因突变、功能异常的可能性会增加，进而直接影响到卵母细胞的质量[6]。Simsek-Duran[7]等通过透射电子显微镜观察不同年龄阶段老鼠卵母细胞线粒体后发现，和年轻的老鼠相比，老龄鼠卵母细胞中的线粒体的数量明显减少，最终导致卵母细胞质量的下降。

2.mt DNA与卵巢衰老

线粒体拥有自己独立的遗传物质—mt DNA，是独立于n DNA之外、通过母系遗传的一组遗传物质。mt DNA拷贝数减少及mt DNA突变率增加导致线粒体功能异常，进而影响卵母细胞的质量以及胚胎发育状况。

在细胞中，mt DNA编码呼吸链上13种蛋白，其中包括复合体Ⅰ中7个亚基、复合体Ⅲ中1个亚基、复合体Ⅳ中3个亚基、复合体Ⅴ也就是ATP合酶的2个亚基。聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术可检测人成熟卵子中mt DNA含量约为20 000～800 000个拷贝数不等[8]。而mt DNA拷贝数对卵母细胞的受精和早期胚胎发育有重要影响，可用来评价胚胎的质量[9]。mt DNA拷贝数下降，可影响线粒体呼吸链上13种蛋白质亚基的转录及翻译，导致线粒体供能异常，影响受精卵和胚胎发育的质量。与n DNA相比，mt DNA没有组蛋白的保护，而是被核基因编码的线粒体转录因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM或mTFA)蛋白包裹着，无有效的修复系统，处于高自由基环境中，故mt DNA更容易遭受氧化应激，导致其结构突变，表达发生改变，引起呼吸链功能障碍，ATP减少，进一步增加mt DNA突变率及ROS产生进入恶性循环中。有文献报道，mt DNA突变率和死亡率是nDNA的20倍左右[10]。当其受到不可修复的氧化应激时，线粒体呼吸链会被中断，线粒体的膜电位平衡被打破，线粒体氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS) 能力降低，合成三磷酸腺苷(adenosine trisphosphate,ATP)的能力减弱，最终导致卵母细胞的受精率和胚胎发育能力降低[11]。Santos[12]等通过研究发现，受精的卵子中mt DNA拷贝数比退化的卵子中的数量要高许多，也就是说，可以通过检测卵母细胞中的mt DNA的拷贝数来评价卵母细胞的质量。

另外也有研究证实[13]，随着女性年龄的增加，卵母细胞中的mt DNA的突变率和缺失率会显著增高。Hsieh[14]等指出，随着女性年龄增长，卵母细胞中mt DNA拷贝数减少、转录水平降低，女性卵母细胞的发育潜能降低。目前为止，研究人员已经找出了超过150种不同的mt DNA突变方式，其中最常出现的是Δmt DNA 4977片段缺失，该片段重排突变现象成为衰老的一个重要标志[15]。

3.ROS与卵巢衰老

正常情况下，机体内促氧化剂水平与抗氧化剂水平处在一种动态平衡之中。适量的ROS能够维持细胞的生理功能，不仅参与调节细胞能量代谢、信号转导、启动有丝分裂及防御病原体等，而且还参与卵泡发育、卵母细胞成熟、排卵、黄体功能及卵泡闭锁等过程[16]。若ROS产生过量或细胞抗氧化机制受损时，超出机体清除ROS的最大负荷量，体内ROS过量累积会引发细胞氧化应激(oxidative stress,OS)反应，破坏细胞的结构，最终可能导致DNA损伤、8-羟基脱氧鸟苷 (8-hydroxy-desoxyguanosine,8-OHdG) 的形成[17]，引起细胞的衰老及凋亡。褪黑色素(melatonin,MT)及其代谢产物可直接作为自由基清除剂，参与调控卵泡的生长发育、促进卵母细胞成熟和改善黄体功能，降低 ROS 产生并抑制 8-OHdG 形成，从而保护DNA 免受于氧化应激的损伤[18]。

颗粒细胞在活动过程中产生的抗氧化酶是清除ROS的主要因素，但随年龄的增长，卵母细胞中抗氧化物酶的活性逐渐降低，进而影响卵母细胞质量。有研究显示，在饮食和基因突变诱发的肥胖模型中，卵母细胞的氧化应激标记物(如ROS等) m RNA表达水平显著升高及抗氧化标记物(如GSH-Px、SOD和CAT等)明显减少[19]，诱导氧化应激，从而改变卵母细胞线粒体的分布，降低卵母细胞减数分裂成熟，破坏纺锤体形态并减少卵母细胞极性，最终导致卵母细胞质量下降。有文献证实[20]，ROS与抗氧化剂之间的平衡能够对卵母细胞的发育产生重大的影响，随着女性年龄的增大，机体的抗氧化能力降低，二者之间的平衡被打破，因此机体内会累积过多的ROS，损坏线粒体的功能，容易攻击线粒体膜，破坏其氧化磷酸化，使线粒体产生ATP的能力降低，线粒体基质中钙离子的储存降低，细胞质中的钙离子水平增加。然而细胞质内的钙离子浓度增加可引起细胞功能的紊乱，通过激活线粒体凋亡通路导致细胞减数分裂周期停滞和细胞凋亡[21]。另外，ROS抑制钠钙交换体活性和钙离子信号分子钙调蛋白活性，使内质网钙离子储存减少、细胞质内钙离子增加，从而使钙离子稳态出现异常[22]，降低卵母细胞质量，导致卵母细胞凋亡。

三、线粒体替代疗法改善卵母细胞质量

卵母细胞数量减少及卵母细胞质量下降共同作用可导致卵巢衰老，随着年龄的增长女性卵母细胞数量呈递减趋势，故可改善卵母细胞质量而延缓卵巢衰老。而在卵母细胞中，线粒体的含量最多，它不仅作为能量工厂提供能量ATP，并且还维持钙离子的稳态等生理功能，起着重要作用，是卵巢衰老的决定性因素[23]。因此理论上可以通过改善线粒体功能或增加线粒体数量[24]来实现提高卵母细胞质量的目的。

近年来，越来越多的不孕患者通过辅助生殖技术得以受孕。对高龄不孕患者以及反复治疗失败的不孕患者，学者们尝试利用线粒体替代疗法这一新的生殖工程技术来改善卵母细胞质量提高助孕率[25]。线粒体替代疗法即体外分离供体细胞的线粒体，通过显微注射植入MⅡ卵细胞，进而促进卵细胞成熟并提高受精发育能力，其中包括原核移植、线粒体移植或胞浆移植、纺锤体移植和极体移植等，并取得了一定疗效[26]。目前线粒体移植取得很大的进展且具有一定的前景。2015年初，英国首先批准了线粒体移植技术用以治疗不孕[27]。异体线粒体移植有异质性问题及伦理问题，故线粒体移植必须取自自身细胞并且含有高质量、没有基因缺失或突变的线粒体[28]。Tzeng等[29]在2001年首次报道，应用患者自体卵丘颗粒细胞线粒体移植至卵母细胞进行辅助生殖并且成功实现了3例临床妊娠。在自体线粒体移植过程中卵巢干细胞(ovarianstem cells,OSC)为自体线粒体的优选。因颗粒细胞与卵细胞紧挨着，对卵细胞成熟发育的整个过程发挥着重要作用，因此，颗粒细胞的线粒体与卵细胞线粒体结构及作用大致相似，为最佳的供体。

因此，自体生殖系干细胞线粒体移植(autologous germline mitochondrial energy transfer,AUGMENT)为改善卵细胞质量提供了新的方向[30]。它通过ICSI将来源于OSC的线粒体与精子一起注射到卵母细胞中,最大限度地避免异质化风险并改善卵母细胞质量。线粒体的替代疗法在操作的安全性及伦理性仍有争议，故在临床上还未被广泛应用，需要进一步研究印证其有效性及安全性[31]。

四、展望

综上所述,线粒体是卵巢衰老的决定因素，线粒体的功能与卵母细胞质量密切相关。目前有很多研究已显示线粒体的功能对卵母细胞的质量有重要的影响，但其中的影响机制有待进一步的研究。近年来，随着“二胎”政策的开放，越来越多的高龄女性进入备孕，为深入了解线粒体与卵母细胞衰老的关系并探索改善卵母细胞质量的方法。通过改善线粒体质量的手段提高卵子质量和妊娠率，提供更优化的助孕策略，将具有重要意义。