兔眼蓝莓组培体系建立及多倍体诱导研究

何梦铃 杨娜 刘小珍

摘要    蓝莓具有较高的营养价值和经济价值，但其繁殖速度慢、果实较小、采摘成本高，优化现有的蓝莓品种具有良好的发展前景。本文以兔眼蓝莓灿烂幼嫩茎段为试验材料开展组织培养研究，采用不同的培养基配比激素以及设置不同浓度用以研究出最适合兔眼蓝莓灿烂生长的、稳定的、可重复性强的培养基配方，建立叶片再生体系，并采用秋水仙素培养基添加法对其进行诱导。在无菌条件下切取由叶片再生形成的长势较好苗的带叶茎尖（长约0.5 cm），接种到秋水仙素浓度为10、20、30、40、50、60 mg/L的6种培养基中。结果表明，最适兔眼蓝莓灿烂腋芽启动培养基是配方WPM+0.005 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，诱导效果最佳，发芽率高达93%以上;取离体叶片再生芽苗的茎尖进行共培养诱导多倍体，50 mg/L秋水仙素处理50 d和60 mg/L秋水仙素处理30 d或40 d时，诱导植株变异的效果最佳，变异率均达30%以上。

关键词    兔眼蓝莓;组织培养;秋水仙素;培养基添加法;多倍体

中图分类号    S663.9        文獻标识码    A

文章编号   1007-5739（2019）23-0059-03                                                                                     开放科学（资源服务）标识码（OSID）

Abstract    Blueberry has high nutritional value and economic value，but its propagation speed is slow，the fruit is small，the harvesting cost is high，so the optimization of existing blueberry varieties has a good development prospect. In this study，the young stem segment of Vaccinium ashei ′Brilliant′ was used as the experimental material to carry out tissue culture research. Different ratios and concentrations of hormones were used to develop the most suitable component for the stable and reproducible culture medium of V. ashei ′Brilliant′.The leaf regeneration system and polyploidy induction system were established，and it was induced by colchicine medium addition method. Under sterile conditions，the leaf tips of the growing seedlings （about 0.5 cm long） formed by leaf regeneration were inoculated into 6 mediums containing colchicine concentration of 10，20，30，40，50，60 mg/L. The results showed that the optimal axillary bud initiation medium for V. ashei ′Brilliant′ was WPM+0.005 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT+20 g/L sucrose+6 g/L agar，the inducing effect was the best，and the germination rate was over 93%. The leaf tips of the growing seedlings formed by leaf regeneration in vitro was co-cultured to induce polyploidy，when treated with 50 mg/L colchicine for 50 d and 60 mg/L colchicine for 30 d or 40 d，the plant variation effect was the best，the variation rate was over 30%.

Key words    Vaccinium ashei;tissue culture;colchicine;medium addition method;polyploidy

蓝莓为杜鹃花科（Vacciniaceae）越橘属（Vaccinium）植物，是一种多年生灌木小浆果果树[1]。蓝莓是越橘属中经济价值较高的一种，其生态适应性、长势和抗病虫性较强，且品质佳，口感好，主要优良品种有杰兔、灿烂、园蓝、巨丰等[2]。其果实中含有丰富的营养成分，具有增强人机体免疫、软化血管、抗癌、强心、保护视力、防止脑神经老化等功能。作为一种新的经济类型水果，也被广泛用于鲜果、饮料、保健用品等食用形式，需求量较大。因此，蓝莓具有较高的经济价值，有较好的经济发展前景。

随着我国对蓝莓引种栽培规模日益扩大，优良种苗需求量急剧增加。蓝莓的传统繁殖方法主要是扦插法繁殖和嫁接繁殖法，这种方法繁殖速度慢，其种苗生产仍然供不应求。而组织培养可以在蓝莓的任意生长阶段进行扩繁，可以迅速去除蓝莓中病毒，变异性小，且可在较小空间内快速地获得大量无性系组培苗。因此，组织培养更能满足快速发展蓝莓栽培的需要。

关于蓝莓的组织培养扩大繁殖，国外已有大量的报道。目前，已经在高丛、矮丛及兔眼蓝莓的多个类群中进行了离体再生的研究[3-11]。

目前普遍栽培的兔眼蓝莓为二倍体，存在营养物质含量和产量相对较低、果实较小的缺陷，而多倍体蓝莓不仅生长势和抗性强，且果实产量高、品质好、果大。多倍体育种对于兔眼蓝莓的耐贮性、抗逆性和增大果个等特性有很大的提高[12]，能培育出更有经济价值的品种。

蓝莓品种的多倍体诱导是多倍体离体诱导的重要研究对象且蓝莓果实较小，不适宜机械采收，人工采收费用高，而多倍体植株在遗传学上具有巨大性。为解决繁殖系数低、果小、病毒等问题，本研究拟以兔眼蓝莓优良单株进行组织培养，确立最适合兔眼蓝莓生长的、稳定的、可重復性强的培养基配方，建立组培体系，进而对长势较好的茎尖进行多倍体诱导，获得的变异植株可用作于兔眼蓝莓的多倍体研究从而解决果个小等问题。

1    材料与方法

1.1    供试材料

采用生长旺盛的灿烂品种的嫩枝作为试验材料，所有的外植体材料均采自西南林业大学优良蓝莓种质资源圃。

1.2    兔眼蓝莓叶片再生体系建立

1.2.1    外植体的选择与消毒。选取灿烂的当年生嫩茎，去除叶柄和叶片，用肥皂水洗净，在线状自来水下冲洗1～2 h，剪成1～2 cm长、含1～2个叶腋的茎段，放于灭过菌的外植体缸内，移至超净工作台上，并设计不同处理时间、不同浓度组合处理的消毒方法，放于灭过菌的垫有滤纸的接种盘内，使滤纸能够吸干外植体表面的残留水分。在接种7 d后统计污染率。每个处理组合接种30瓶，重复3次。最终确定处理组合5（75%酒精18 s、0.1%升汞10 min、暗培养7 d）为最优消毒方案，污染率仅为3.3%，发芽率高达93%。

1.2.2    腋芽诱导与增殖培养。不定芽增殖正交实验，影响因素包括ZT、NAA。具体方案如表1所示。将茎段两端分别切去2～4 mm，平放在启动培养基上，叶腋朝上，接种在各种不同激素组合的培养基中，其中含20 g/L蔗糖、6 g/L琼脂，pH值为5.7～6.0。置于暗培养环境即培养温度（25±3）℃、暗培养8～10 d，再置于昼培养环境即培养温度（25±3）℃、光照16 h/d、光照度为2 000 lx培养8周后，统计腋芽数量。每个处理组合接种30瓶，重复3次。最终确定最佳腋芽诱导培养基为5号处理，即WPM+0.005 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT，诱导率为93%以上。

待腋芽发出时，将外植体转到继代培养基上，用于芽的伸长生长，继代培养基的配方为：WPM+0.05 mg/L NAA+2.0 mg/L ZT+20 g/L蔗糖+6 g/L琼脂，pH值为5.7～6.0。置于昼温（25±3）℃、光照16 h/d、光照度为2 000 lx培养的条件下培养3周后，腋芽长出2～3 cm高腋芽，同时剪下腋芽进行增殖培养，建立组培体系。

1.3    多倍体诱导

采用陈冰心[2]的多倍体诱导方法（培养基添加法）并稍作改变，设秋水仙素的浓度为10、20、30、40、50、60 mg/L，不同浓度下分别处理10、20、30、40、50 d。首先，在无菌条件下切取由叶片再生形成的长势较好苗的带叶茎尖（长约0.5 cm），接种到秋水仙素浓度为10、20、30、40、50、60 mg/L的6种培养基中，以不含秋水仙素的培养基作为空白对照组。在温度（25±3）℃、光强2 000 lx、光周期16 h光照/8 h黑暗的环境中，受不同浓度秋水仙素处理的茎尖，每种浓度分别进行10、20、30、40、50 d的共培养（即不包括空白对照有30个处理），每个培养瓶中接种7个左右的茎尖，每个处理重复3次。共培养结束后，在超净工作台上将茎尖取出，接种到不含秋水仙素的WPM培养基中继续培养。培养期间，每隔10 d观察1次，并统计其存活率[13-14]，计算公式如下：

存活率（%）=（存活个数/接种个数）×100

经过一段时间的培养，对比未经过秋水仙素处理的植株生长情况，观察并统计经过秋水仙素共培养处理后出现明显变异的植株，如具有植株表皮毛较多、叶片更厚、颜色更浓绿、茎杆较为粗壮、分枝能力增强、节间变短等特征的植株，以便进行初步的加倍植株的筛选，统计变异率[15-16]。计算公式如下：

变异率（%）=（出现形态变异的个数/接种个数）×100

2    结果与分析

2.1    秋水仙素处理浓度和时间对兔眼蓝莓外植体存活率和形态变化的影响

适宜浓度的秋水仙素能够破坏分裂中期的纺锤丝，导致复制的染色体不能向两极移动，从而使细胞中染色体组加倍[2]。

本试验用培养基添加秋水仙素的方法诱导多倍体苗，在诱导培养过程中发现，处理相同时间的情况下，秋水仙素浓度越高的苗生长越缓慢，如图1所示。在10 mg/L秋水仙素处理40 d的培养条件下，幼苗生长较快，茎较细;而在50 mg/L秋水仙素处理50 d的培养条件下，幼苗生长较缓慢，并出现了茎加粗的幼苗。

从表2可以看出，随着处理浓度的增大，外植体的平均存活率越低，当处理浓度为10 mg/L时，作用效果不明显，平均存活率为99.42%;当处理浓度为60 mg/L时，平均存活率则只有75.42%。而随着处理时间的延长，存活率有下降的趋势，但是影响效果不是特别明显。