上海地区草莓灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性现状研究

陈 秀，张颂函，张正炜，黄兰淇，何翠娟

(上海市农业技术推广服务中心/上海市农药检定所，上海 201103)

灰霉病是一种世界性的重要病害，也是上海地区草莓生产上的一种重要病害，主要由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起，严重影响草莓的品质和产量[1]。目前，化学防治仍是控制该病害的重要手段。灰霉病菌有繁殖快、遗传变异大和适合度高等特点，连续使用同一药剂极易产生抗药性[2～3]。

啶酰菌胺是由德国巴斯夫公司1992年开发、2004年登记的烟酰胺类杀菌剂，2006年在欧美等国家已广泛应用[4]。作为防治蔬菜瓜果灰霉病效果优良的一种较新的杀菌剂，啶酰菌胺已连续5年作为“上海市农药重点推荐品种”推荐农户使用。啶酰菌胺属于琥珀酸脱氢酶抑制剂类(succinate dehydrogenase inhibitors，SDHIs)杀菌剂，能与呼吸链上的蛋白质复合物Ⅱ的辅酶Q位点特异结合，抑制病原菌琥珀酸脱氢酶活性，从而干扰其呼吸作用[4]。SDHIs已广泛用于防治蔬菜、果树等作物的灰霉病，但由于其作用位点单一，长期广泛的使用容易产生田间抗性菌株，国际杀菌剂抗性委员会已将其归为中度抗性风险杀菌剂[5]。啶酰菌胺是此类杀菌剂中的重要品种，故其抗性风险备受关注。

目前，灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性菌株在国外已有多例报道[6]，国内也有检测出抗性菌株的报道[7]，但上海地区灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性现状尚无系统研究及报道。啶酰菌胺作为上海的重点推荐农药品种，开展灰霉病菌对其的抗性现状研究对进行抗性风险评估、指导科学合理用药和提出抗性管理措施具有十分重要的意义。

1 材料与方法

1.1 菌株的采集与分离 2016年3～5月，在上海地区19个草莓种植点采集了草莓灰霉病样。病样采集采用经无菌水浸湿的消毒棉签轻轻蘸取病果表面灰霉菌霉层后直接放入自封袋中，每个病果只蘸取1次。每种植点采集5个大棚，同一个大棚中采集病果2～3个，每种植点共采集病果10～15个。

用镊子从棉签上挑取少量粘附菌体的棉絮，接种在含硫酸链霉素的培养基平板上。置于25℃培养4～5d(直到产生孢子为止)，用灭菌的挑针挑取孢子，移到新的培养基平板上，获得115株纯分离物。将115株纯分离物编号后保存在冻存管斜面上，置于4℃保存，供试草莓灰霉病菌菌株(表1)。

表1 供试草莓灰霉病菌菌株及其来源

续表

1.2 供试药剂与培养基 啶酰菌胺原药(98.0%)由上海悦联化工有限公司提供。

培养基采用PDA培养基。称取37g马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)粉，加入1 000mL蒸馏水，加热煮沸溶解，121℃高压灭菌20min，配制PDA培养基。草莓灰霉菌株分离纯化制作培养基平板前加入硫酸链霉素，调整终浓度为100mg/L。测定草莓灰霉病菌对啶酰菌胺敏感性数据时，将啶酰菌胺母液按一定比例加入配制好的PDA培养基(灭菌后，冷却至50℃左右加入)，配制成系列浓度的含药培养基。

1.3 草莓灰霉病菌对啶酰菌胺敏感性的测定 采用菌丝生长速率法[8]，将分离得到的115株灰霉菌株在含药平板上进行对啶酰菌胺敏感性的测定。将已纯化的灰霉菌株接种于PDA平板上，置于25℃培养至近全皿时，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌块，表面朝下接种于系列含药的PDA平板上，以无药的PDA平板作为对照，每个处理重复3次。将接上菌块的培养皿置于25℃恒温培养箱培养5d，用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。所得数据用SPSS17.0进行处理，求出毒力回归方程和EC50值。

灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感基线参照张传清等2007年报道的采用菌落直径法建立的灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感基线1.07±0.11mg/L[9]。抗性指数(RF)=测定菌株的EC50/敏感基线的EC50[10]；敏感菌株(S)：RF≤5，低抗菌株(LR)：5100[11]。

1.4 啶酰菌胺对草莓灰霉病田间药效试验 2017～2018年，在4个草莓种植点开展了50%啶酰菌胺水分散粒剂防治草莓灰霉病的田间药效试验(每年2点)。试验剂量设为50%啶酰菌胺水分散粒剂防治草莓灰霉病登记的最高制剂用量45g/667m2，间隔7d施药1次，共施药3次，考察啶酰菌胺防治草莓灰霉病的实际防效。试验中以生产上种植户常用来防治草莓灰霉病的嘧霉胺常用剂量作为对照。具体试验方法参照农药田间药效试验准则(二)第120部分[12]。

2 结果与分析

2.1 上海地区草莓灰霉菌对啶酰菌胺的敏感性 采用菌丝生长速率法对分离获得的115株灰霉菌株进行测定，获得上海地区草莓灰霉病菌对啶酰菌胺的EC50值。各区灰霉菌株的EC50值分布范围和平均EC50值(表2)。由表2可看出，所有灰霉菌株EC50值在0.028～186.435mg/L之间，不同菌株之间EC50值有较大的差异，表明上海地区草莓灰霉菌株对啶酰菌胺的敏感性已产生了一定程度的分化。

参考张传清等2007年报道的灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感基线1.07±0.11mg/L，可以得出抗性菌株共检测到16株，其中低抗菌株2株、中抗菌株12株、高抗菌株2株。上海地区草莓灰霉病菌对啶酰菌胺的抗性频率为13.9%，以中抗为主(10.4%)，低抗和高抗频率均为1.74%。从各区的抗性菌株检出情况来看(表3)，闵行、奉贤和崇明未检测到抗性菌株，青浦抗性菌株检出率最高、嘉定和浦东次之。测得的2株高抗菌株分别是青浦1株和浦东1株。

表2 上海9个区草莓灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感性测定数据

表3 上海地区草莓灰霉病菌抗性菌株数量及比例

2.2 啶酰菌胺防治草莓灰霉病田间药效试验数据 本文还研究了50%啶酰菌胺水分散粒剂在最高登记剂量(45g/667m2)防治草莓灰霉病的田间药效，试验数据(表4)。从2年的田间试验数据看，啶酰菌胺对草莓灰霉病的防效优于嘧霉胺，防效尚可，在75.45%～83.72%之间。方差分析表明仅2018年第3次药后二药剂在试验剂量下对草莓灰霉病的防效差异显著。从年度间进行比较，2017、2018两年间啶酰菌胺对草莓灰霉病的防效差异并不明显。就田间实际防效来看，目前在上海地区使用啶酰菌胺防治草莓灰霉病是可行的。

表4 50%啶酰菌胺水分散粒剂防治草莓灰霉病田间药效试验数据

3 结论

本文测定了上海地区草莓灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感性数据，数据结果表明，上海地区草莓灰霉病菌对啶酰菌胺已经产生了一定的抗性，总抗性频率为13.9%，抗性菌株多为中抗菌株(10.4%)，但也检测到2株高抗菌株(1.7%)，抗性状况需引起一定的重视。啶酰菌胺防治草莓灰霉病三次药后的田间防效在80%左右，防效尚可满足生产需要，数据表明目前在上海地区使用啶酰菌胺防治草莓灰霉病仍旧是可行的。

结合两方面的研究数据，笔者认为，在实际生产中要加强对草莓种植户的宣教，指导其科学合理用药，轮换使用防治草莓灰霉病的杀菌剂，可加大使用生物制剂如枯草芽孢杆菌的使用次数，避免长时间使用啶酰菌胺造成灰霉病菌对其抗性的急剧发展，延长防效优良的杀菌剂啶酰菌胺的使用寿命。