5-氮-2-脱氧胞苷对人膀胱癌细胞株5637细胞生长及RUNX3基因甲基化的影响

王 磊

（江西卫生职业学院，江西南昌，330052）

RUNX3(human runt—related transcription factor 3)基因是近来研究较多的一个肿瘤抑制基因，该基因是位于染色体lp36，全长67kb，内有启动子p1、p2两个、外显子6个和开放阅读框1290bp[1]。在这2个启动子中富含有GC，特别是在p2启动子中GC的含量为64%，容易出现甲基化改变[2]。对于基因的甲基化和去甲基化现象，这是细胞生长和分化的重要程序，可是在肿瘤的发生发展中则会发生紊乱。研究中，通过在使用不同浓度的去甲基化药物5-Aza-CdR对膀胱癌5637细胞株处理后，检测RUNX3基因的甲基化情况、表达变化、对细胞增殖及凋亡的影响，进而可能为膀胱癌的早期诊断与检测、治疗以及预后提供依据，寻找新的治疗靶点。

1、实验材料

膀胱癌细胞株5627细胞。

2、实验方法

2.1 细胞培养、分组 将处于对数生长期的5637细胞株接种到细胞培养板，分为 A、B、C、D4个组别。

2.2 加入不同浓度5－Aza－CdR培养 4组分别加入未加药的细胞株作为对照组(A组)、加入低浓度（1umol/l）(B组)、中浓度（16umol/l）(C 组)、高浓度（64umol/l）(D 组)的 5－Aza－CdR，继续培养，收集上述几组实验组细胞待测。

2.3 流式细胞仪 检测各个组别的细胞凋亡情况。

2.4 甲基化特异性PCR(MSP)方法 检测给药前后RUNX3基因甲基化的差异。

2.5 RT－PCR法 检测用药前后RUNX3基因mRNA表达的变化。

2.6 Western blot检测 用药前后RUNX3蛋白表达水平的差异。

3、统计学处理

采用SPSS19.0统计学软件对所有数据进行分析处理，PCR数据和流式细胞数据均采用Welch检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

4、实验结果

4.1 不同浓度5-Aza-CdR对膀胱癌5637细胞增殖的影响 与对照组相比较，膀胱癌5637细胞用5-Aza-CdR处理后，细胞的增殖受到抑制，差异有统计学意义（P＜0.05）。不同浓度的5-Aza-CdR作用下，细胞增殖抑制程度有差异性，有统计学意义（P＜0.05）。结果表明，随着5-Aza-CdR浓度的不断增加，膀胱癌5637细胞的抑制率明显增大。

4.2 不同浓度5-Aza-CdR对膀胱癌细胞株5637细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测，5637细胞在5-Aza-CdR作用后，实验组与对照组存在差异，差异有统计学意义（P＜0.05），不同浓度的实验组，组间有差异，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果显示，5-Aza-CdR作用后，细胞凋亡率增加。随着浓度的不断增加，细胞凋亡率也在增加，成剂量依赖性关系。

4.3 5-Aza-CdR对膀胱癌5637细胞RUNX3基因甲基化的影响 甲基化特异性PCR（MSP）法用于检测膀胱癌5637细胞RUNX3甲基化，从实验结果可以看出实验组（5-Aza-CdR浓度为16umol/l）和对照组(未添加5-Aza-CdR)RUNX3甲基化不同。处理前，甲基化引物扩增条带呈阳性，非甲基化引物扩增条带呈阴性。用5-Aza-CdR处理后，膀胱癌5637细胞的甲基化引物扩增条带表现为阴性，而非甲基化引物扩增条带表现为阳性。

结果表明，膀胱癌537细胞中RUNX3基因存在甲基化，药物5-Aza-CdR可逆转RUNX3甲基化状态，使其成为非甲基化状态。

4.4 不同浓度5-Aza-CdR处理后对膀胱癌5637细胞RUNX3 mRNA的表达影响 RT-PCR检测在不同浓度5-Aza-CdR处理后，5637细胞RUNX3mRNA的表达情况。结果可以看出，5-Aza-CdR处理后RUNX3mRNA的表达增加，差异具有统计学意义（P＜0.05），各组之间随着 5-Aza-CdR浓度不断增加，RUNX3mRNA的表达也不断增加，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果显示，膀胱癌5627细胞经过5-Aza-CdR处理后，随着浓度的增加RUNX3 mRNA的表达也不断增加。

4.5 不同浓度5-Aza-CdR处理后对膀胱癌5637细胞RUNX3蛋白表达的影响 实验结果显示，与对照组相比，5-Aza-CdR处理膀胱癌5637细胞后，RUNX3蛋白的表达增加，差异有统计学意义（P＜0.05），不同浓度5-Aza-CdR之间，RUNX3蛋白的表达有差异，有统计学意义（P＜0.05）。随着浓度的不断增加，RUNX3蛋白的表达也在增多。

5 讨论

随着我们对肿瘤的深入研究，显示肿瘤的发生可能与癌基因的激活和抑癌基因的失活等存在联系，因此，寻找与肿癌相关的抑癌基因对了解肿瘤的发病、监测、预后判断以及开展基因治疗有十分重要的意义。

膀胱癌是目前我国最为常见的泌尿系统肿瘤。膀胱癌的诊断主要是依赖膀胱镜检查以及病理活检，但对于膀胱癌早期的监测较差。因此，努力找到一种能够早期对膀胱癌作出诊断且敏感性和特异性均比较高的肿瘤标志物，找到可行性的治疗方式，这将为膀胱癌的诊断、生物治疗及预后提供很大的帮助。

5.1 RUNX3基因的甲基化与肿瘤 RUNX3基因甲基化的出现主要是在p2的CpG岛，基因出现甲基化后，将导致基因的表达受到抑制，而RUNX3表达受到抑制，将会影响细胞的凋亡，促进肿瘤的发展。

在之期的研究中，40例膀胱癌和10例正常膀胱黏膜组织中，RUNX3基因在膀胱组织的阳性表达率（40%，16/40）明显低于其在正常膀胱组织中的阳性表达率（90%，9/10）（P ＜0.05）；RUNX3基因在膀胱癌组织中的阳性表达与患者年龄、性别因素无关（P＞0.05），与膀胱癌组织的病理分级和临床分期有关（P＜0.05）；在本次实验中，通过MSP法检测膀胱癌5637细胞发现RUNX3基因存在甲基化。这也进一步证实了RUNX3基因的甲基化造成了抑癌基因RUNX3的失活。

5.2 5-Aza-CdR的作用 5-Aza-CdR作为甲基化抑制剂，可使甲基化状态的基因重新激活表达，促进癌细胞凋亡及抑制癌细胞增殖，从而发挥抗癌作用。刘正人等[3]探讨5-Aza-CdR对胆管癌细胞TFK-1侵袭力的影响及其机制，发现5-Aza-CdR对胆管癌细胞侵袭力有显著性抑制。本次实验中，在经过5-Aza-CdR处理后，膀胱癌5637细胞的增殖率下降，细胞凋亡率升高，并且随着5-Aza-CdR浓度的不断增加，细胞凋亡增加。这和其他人研究结果相同，说明5-Aza-CdR可以作为膀胱癌治疗的一个考虑方向。

5.3 5-Aza-CdR与RUNX3的去甲基化 基因的甲基化属于表观遗传学修饰，是一种可逆的过程，通过甲基化抑制剂可以诱导抑癌基因的重新表达，从而达到治疗肿瘤的目的。[4]

之前，唐莉菲等[5]对40例宫颈癌患者进行了研究，观察到RUNX3启动子异常甲基化与宫颈癌的发生发展有关，有望在宫颈癌的早期检测中成为生物学标志之一。本次实验发现，在膀胱癌5637细胞中，经过不同浓度5-Aza-CdR处理后，随着浓度的增加，RUNX3mRNA表达随之增加，RUNX3蛋白增加。这些说明，5-Aza-CdR使RUNX3基因发生去甲基化，RUNX3基因重新表达，进而促使细胞的凋亡。

6 结论与展望

6.1 结论 5-Aza-CdR使膀胱癌5637细胞的生长受到抑制，细胞凋亡增加，可能是由于RUNX3基因的甲基化出现逆转，RUNX3抑癌基因表达增加。检测RUNX3基因可能有助于膀胱癌的早期发现，而RUNX3基因也可以作为膀胱癌基因治疗的一个新参考靶点，5-Aza-CdR为膀胱癌的治疗提供了一个可供参考的方向。

6.2 进一步工作的方向 基因的甲基化是一种由DNA甲基转移酶(DNMT)介导的化学修饰过程，也是一个可逆的过程。因此，如果使肿瘤中因甲基化而失活的抑癌基因去甲基化，那么抑癌基因可能可以被重新激活，从而恢复其功能。那么，RUNX3基因的甲基化是否还可以通过其他药物实现去甲基化，与5-Aza-CdR相比，效果如何，是否还有其他抑癌基因也有类似的情况，这些都值得深入研究。