藜麦黄酮类化合物的提取及测定方法研究进展

付荣霞，周学永*，李航，崔艳，Rajasab A H

(1.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津农学院食品科学与生物工程学院， 天津 300384; 2.古尔巴加大学 科学技术学院，印度 古尔巴加 585308)

原产于南美洲安第斯高原的藜麦为藜科藜属的一年生植物[1]。藜麦具有丰富的营养价值，蛋白质、淀粉及脂肪含量分别为12.5%～16.7%、58.1%～64.2%和5.5%～8.5%，且含有均衡比例的必需氨基酸[2]、多种维生素、矿物质，除此之外，还含有生物活性的功能成分黄酮、皂苷、多酚等[3-5]。联合国粮农组织指出藜麦是将来最具有开发价值的农作物之一，是最适合人类食用、营养全面的食物[6]。藜麦的黄酮类含量较其他谷物类要高，例如，芦丁、槲皮素、异槲皮素和山奈酚比荞麦高，其余谷物类如大米、玉米等都不含黄酮类。在不久的将来可以将藜麦加工成具有保健功能的调味品，例如，藜麦酱油、藜麦醋、藜麦蚝油等。黄酮类化合物的药理作用有多种，如降低血压、降低血脂、抗氧化、抗病毒、抗癌、防癌等[7-9]，因此，在食品、药品行业中应用广泛，由于黄酮类化合物呈现黄色，是良好的天然色素，可用于食品加工业；提取的总黄酮也可用于制备调味品[10-12]。由此可见，对黄酮类化合物的提取及测定方法的探索意义重大。

1 藜麦黄酮类化合物提取方法

目前，常用溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法提取藜麦黄酮类化合物。

1.1 溶剂提取法

溶剂提取法依据的原理是相似相溶，通过渗透、扩散等方式使溶剂进入细胞内部，可溶性物质溶解，导致细胞内和细胞外浓度不同，为了保持溶液的平衡，水分子从浓度低的一方扩散到浓度高的一方。选用的提取溶剂要对黄酮化合物有较大的溶解度，且不与其发生反应，此外，还要考虑溶剂的安全性、是否经济易得等。最常用于黄酮类化合物的提取溶剂为甲醇、乙醇、丙酮和水。溶剂提取法的优点是易于操作、设备简单、成本低等，但同时也有一些缺点，如产率不高、溶剂易残留、安全性低等。华艳宏等[13]利用超声波浸提方式，分别选用不同的溶剂(蒸馏水、甲醇、丙酮、乙醇等)研究藜麦种子提取物中总黄酮的含量，结果显示：由于溶剂的不同提取得到的藜麦种子总黄酮在1.34～1.98 mg/g范围内变动，其中，得到总黄酮较高的溶剂为70%乙醇、蒸馏水，但两者差异不显著。孙雪婷等以藜麦种子为材料，采用乙醇回流法提取总黄酮，对影响提取率的因素进行研究。结果显示：影响最大的为料液比，其次为提取时间，再次为乙醇体积百分数，影响最小的为提取温度，得到的最优提取条件是80%的乙醇，料液比1∶30， 60 ℃提取60 min，采用此工艺条件，得到2.64 mg/g黄酮。

1.2 微波辅助提取法

微波可以转变电磁能为热能，引起样品温度很快增高，在加热过程中细胞膜和细胞壁被细胞内液态水汽冲破，出现微小孔洞，溶剂容易进入细胞，有效成分被溶解和释放出来。微波辅助提取法的特点是选择性高、溶剂耗量少、节约能源、受热均匀，可以较好地保留有效成分，产品提取率高。梁彬等[14]利用微波辅助提取法，以乙醇为溶剂提取藜麦种子总黄酮，对其影响因素——料液比、微波功率和时间进行探讨。结果显示：总黄酮的最优提取工艺是料液比1∶50，微波功率260 W下提取125 s，平均提取量为6.5 mg/g。

1.3 超声波辅助提取法

由超声波引起的震动和空化作用可以保持被提取物的结构和生物活性不变，细胞瞬间破裂，通过扩散作用使细胞内的物质释放出来，进入溶剂中。超声波提取易于操作，能够节约提取时间，提高得率。董晶等以藜麦种子为材料，利用超声波提取黄酮，确定的最优条件是：选择超声波功率240 W，80%的乙醇，料液比1∶50，50 ℃浸提30 min。董施彬等[16]确定的去皮藜麦种子黄酮提取的最佳条件是：90%的乙醇，料液比1∶10，超声波提取25 min后， 经90 ℃回流提取2 h，得到总黄酮3.861 mg/g。

2 藜麦黄酮类化合物含量的测定方法

高效液相色谱法和分光光度法主要用于藜麦黄酮类化合物含量的测定，此外，超微弱发光法可用于黄酮含量的快速检测。

2.1 高效液相色谱法

高效液相色谱的流动相是液体，利用高压泵输送洗脱液，使待测样品产生移动，以致各组分被分离，高灵敏度的检测器将其转化成可供检测的信号，实现定性定量分析。特点是测定的样品范围广、效率高、成本低、灵敏度高、测定结果准确等，但设备昂贵、流动相消耗较多、检测时间较长。Hirose等测定了藜麦的黄酮含量(高效液相色谱法)，证实不同品种间存在较大差别，尤其是槲皮素和山奈酚的含量。熊成文等检测了藜麦中槲皮素和山奈酚的含量，选择甲醇溶液(80%)为提取溶剂，先用超声波和热回流提取样品，之后用浓盐酸水解，利用高效液相色谱法检测水解液中两种组分的含量。色谱条件：固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相为CH3OH-0.4%H3PO4溶液(55∶45)，流速1.0 mL/min，柱温30 ℃，进样量20 μL，360 nm波长下进行检测，定量方法为外标法。结果显示：槲皮素和山奈酚的检测范围分别是0.02～0.40 μg和0.01～0.20 μg时，线性关系良好，平均回收率分别是91.0%和89.3%，相对标准偏差分别是0.7%和4.5%(n=9)。马麟等[16]利用超声波辅助提取技术、反相高效液相色谱检测方法研究了藜麦中碳苷黄酮类化合物，色谱柱选用Diamonsil-C18，流动相为酸性甲醇-水，梯度洗脱，固定流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，同时检测样品中的荭草素、异荭草素及牡荆素，结果显示：精密度、重复性和稳定性良好。

2.2 分光光度法

分光光度法具有标准品容易获取、易于操作、测定结果可靠的特点，是黄酮类化合物最常用的定量方法之一。黄酮类化合物中的一些分子相对活跃，能与某些金属盐发生反应，得到有色络合物，可以通过光谱检测到颜色的变化，因此，测定黄酮类化合物常使用硝酸铝和氯化铝等显色剂。陆敏佳等[17]采用分光光度法测定藜麦叶片中黄酮类化合物的含量，发现分光光度法虽然易于操作、结果可靠，但是脂类物质会对测定结果造成影响。重复性试验及回收率试验证明，分光光度法适合测定总黄酮含量，重现性和稳定性良好。由此可见，藜麦叶片中的脂类物质含量不影响黄酮类化合物的提取和测定。冯焕琴等选择乙醇浓度、提取温度和时间3个因素，通过响应面试验研究藜麦种子总黄酮得率，探讨两种显色剂(氯化铝、硝酸铝)的使用对总黄酮测定的影响，结果表明：使用硝酸铝作为显色剂实验误差小，结果稳定，可用于测定藜麦种子中总黄酮的含量。

2.3 超微弱发光法

黄酮含量的快速检测可以利用超微弱发光法。超微弱发光是生物生命活动的表现形式之一，它能灵敏地反映机体的生理生化状态。黄酮类化合物可以阻止自由基链反应，理论上，种子中黄酮类化合物的含量与自由基的数量呈负相关，而后者又与发射的光子数量呈正相关，因此，黄酮类化合物的含量应该与发射的光子数量呈负相关。董艳辉等[18]证实了藜麦种子中黄酮类化合物的含量越高，超微弱发光值就越低，二者之间呈极显著负相关。常规育种时，检测藜麦种子中的黄酮含量需要测定大量样品，操作繁琐，耗费时间较多，而采用超微弱发光法检测，结果比较准确，且检测过程迅速、简单，对种子无损。因为超微弱发光法具有较高的灵敏度，要求较严格的环境，所以精确度不高，在实际操作时各种影响因素都要加以考虑，确保结果的可靠性。

3 结语

藜麦是营养全面的食品，富含多种生物活性成分，有很高的营养价值和极好的保健功能。目前，虽然我国大量种植藜麦，但对藜麦生物活性成分的提取和测定等方面的研究仍处于初步阶段，对藜麦黄酮类化合物的提取方法多数应用传统分离技术，还需要进一步提高提取率，降低提取成本。鉴于藜麦的高潜在利用价值，对提取工艺和测定方法的要求也不断提高，不仅要有高的提取率、好的产品质量，而且测定方法还要求准确简便、省时省力。因此，提高藜麦有效成分的提取率，减少有害成分和杂质的残留，减少环境污染以及发展联用技术以进行实时监测将具有重要的理论意义和广阔的应用前景。