Leachii支原体的致病作用及其传播途径

常继涛，于 力

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病研究创新团队，黑龙江哈尔滨150069)

Leachii支原体最初由Simmons等于1963年在澳大利亚患多发性关节炎犊牛的关节液内分离获得，代表菌株为PG50[1]。之后，该病原菌陆续从患乳房炎的母牛、患关节炎和肺炎的犊牛以及流产胎儿的体内获得分离[2-7]。目前全世界大约有60个leachii支原体分离株，除7株分离于德国、葡萄牙、尼日利亚、法国和中国外，其余所有菌株均分离自澳大利亚。在分类上，leachii支原体作为独立的群，与丝状支原体群和山羊支原体群同属于丝状支原体族成员[8]。2009年，我国北方某大型奶牛场发生leachii支原体引起的犊牛多发性关节炎疫情，本研究团队从患病犊牛的关节液中分离出leachii支原体[2-4]，确定了该病原感染在我国的存在。已有研究表明leachii支原体可以直接引起犊牛多发性关节炎，但其传播途径尚不清楚；此前虽有leachii支原体可能引起犊牛肺炎的报道，但尚无直接证据；leachii支原体也可以在患乳房炎牛的乳汁中分离获得，因此有研究者用1头奶牛的1个乳区进行接种试验可以诱发轻度的牛乳房炎[5]，可是接种动物的数量有限、而且没有病理学特别是免疫组化检测的验证，缺乏leachii支原体作为牛乳房炎原发性病原的直接证据。目前，国内外对leachii支原体的研究主要集中在病原的分离鉴定、遗传进化分类以及致病性等方面，而对该病原的致病机理、传播途径以及防控措施的研究资料还相当有限。近十年来，本实验室对leachii支原体的致病性、传播途径及其致病作用的病理发生机制进行研究，取得了一些创新性研究结果。本文将对近年来本实验室在leachii支原体研究方面的进展进行归纳总结，为leachii支原体病防控技术的研究提供理论依据。

1 Lea chii支原体引起犊牛多发性关节炎的致病作用及其传播途径

Leachii支原体最初是从患关节炎犊牛的关节液内分离获得，并且Simmons等通过关节内注射leachii支原体分离培养物能够复制出犊牛多发性关节炎[1]。2009年，我国北方某大型奶牛场发生的leachii支原体犊牛多发性关节炎疫情，主要临床表现是关节的永久损伤、肢体变形，导致卧地不起和生长迟缓，虽然死亡率不高，但是淘汰率为100%(400/400)，本实验室从患病犊牛的关节液内分离获得leachii支原体[2-4]。进而将leachii支原体分离培养物通过关节腔注射途径接种1月龄健康犊牛，复制出典型的多发性关节炎，呈现与临床发病犊牛高度相似的临床症状和病理变化[3-4]。这些研究结果表明，leachii支原体是引起我国犊牛多发性关节炎疫情的原发性病原。

然而，leachii支原体引起犊牛多发性关节炎的途径传播、以及局限性暴发的流行特点的原因尚不清楚，Alexander和Hum认为犊牛关节炎的发生可能是由于饲喂污染leachii支原体的乳汁而引起[6-7]，可是尚无可靠的证据。本研究团队采用1月龄犊牛作为实验动物，将leachii支原体体外培养物和感染犊牛的关节液分别通过关节内、静脉、气管内、滴鼻以及口服的途径接种犊牛，通过临床评估、病原学检查、病理学以及免疫组化等方法评价不同接种途径犊牛的发病情况，确定leachii支原体对犊牛的致病性、揭示leachii支原体感染犊牛的传播途径。这些研究结果显示：1)所有通过关节内接种leachii支原体体外培养物和感染犊牛关节液的犊牛、以及2/3静脉接种感染牛关节液的犊牛均发生了严重的多发性关节炎，所有发病牛的关节滑膜组织均呈现滑膜细胞坏死和炎性细胞浸润为特征的病理变化，通过免疫组化和PCR方法在这些发病犊牛的关节组织中检测到了leachii支原体，表明leachii支原体通过损伤关节滑膜细胞和炎性细胞浸润而引起关节炎；2)通过气管内、滴鼻以及口服途径接种的其它犊牛未发生任何leachii支原体感染的症状，病原学、病理学以及免疫组化等方法检测也未发现leachii支原体感染，表明leachii支原体引起的犊牛多发性关节炎是通过血液传播，而消化道和呼吸道等水平途径不能传播本病[9]。在自然条件下leachii支原体可以通过血液途径接触感染犊牛的关节液而引起犊牛多发性关节炎。本研究在一个奶牛场的疫情流调中发现，用同一批精液人工授精的母牛所生产的犊牛，发生多发性关节炎的几率为100%，而在同一牛场中使用其它来源精液所繁育的犊牛均不发生这种多发性关节炎。据此认定，用污染精液进行人工授精是leachii支原体引起犊牛多发性关节炎的主要传播途径[4]。

至此，通过本动物感染试验[9]和对疫情的追溯性研究[4]可以确定，leachii支原体引起犊牛多发性关节炎的传播途径为血液接触和精液污染，而消化道和呼吸道等水平途径不能传播该病。这种传播途径也与leachii支原体犊牛关节炎的局限性暴发和散发的流行特点相一致：精液一旦污染，用污染精液繁育的犊牛全部发病，呈现局限性暴发流行的特点；之后发病牛场一定时间内存在该病原，环境中的病原通过外伤接触血液引发感染，呈现零星散发的特征。

2 Leachii支原体引起奶牛乳房炎的致病作用

已有研究显示，从患乳房炎牛的乳汁及乳腺组织中分离出leachii支原体[5,7]。Connole等通过乳头管内灌注将leachii支原体分离培养物接种1头奶牛的1个乳区，复制出轻度的奶牛乳房炎[5]，但目前尚缺乏leachii支原体引起奶牛乳房炎的直接试验证据。本研究室将leachii支原体分离培养物通过乳头管灌注的方式接种6头泌乳母牛的12个乳区，另12个乳区接种热灭活的leachii支原体培养物作为阴性对照乳区，采用临床评估、病原学和病理学检查以及免疫组化检测等多种方法，对leachii支原体引起奶牛乳房炎的致病性进行研究。从接种后的第3 d到第9 d，12个接种乳区均发生了轻度至重度的临床型乳房炎和乳腺组织的病理学改变，包括炎性细胞浸润和乳腺导管的结构破坏。采用免疫组化方法在接种后第6 d，从接种乳区的乳腺上皮细胞中检测出leachii支原体抗原弱阳性信号，在接种后9 d检出强阳性信号。阴性对照乳区在接种后第9 d也发生轻度的乳房炎，并且在乳腺组织中也检测出leachii支原体抗原的存在。整个试验期内，未进行任何接种的阴性对照牛一直正常，乳腺组织中也未检测出leachii支原体。病理学和免疫组织化学结果表明，leachii支原体可以导致牛乳房炎，这种炎症主要是由于病原侵入乳腺上皮细胞引起的结构破坏和炎性细胞浸润所致[10]。

与感染牛饲养在同一牛舍的阴性对照牛始终未发病，表明leachii支原体引起奶牛乳房炎的水平传播能力也较弱。在自然条件下，也许在挤奶或者泌乳高峰时乳头管扩张的情况下接触高剂量leachii支原体，才能引发乳房炎。对2010年至2017年收集的多份患乳房炎奶牛的乳汁样品进行leachii支原体检测，发现只有在leachii支原体犊牛关节炎疫情发生两年内(即2009和2010年)采集的少数乳汁样品中检出leachii支原体，之后收集的乳房炎乳汁样品中均未检测到leachii支原体[11]，这也从侧面证明了leachii支原体引起奶牛乳房炎的水平传播能力有限。而在接种牛的对照乳区中也能检测出leachii支原体，表明leachii支原体可以在体内传播、并能够定植于体内，且支原体对大多数抗生素的天然耐药性，因此leachii支原体一旦感染乳腺则难以清除并治愈。其它支原体引起乳房炎也具有相似的特征，因此临床上一般不建议对患支原体型乳房炎的奶牛进行治疗，淘汰是控制支原体型奶牛乳房炎的常用处理手段[12]。上述研究结果表明，leachii支原体是引起奶牛乳房炎的一种新的致病因子，并初步阐明了leachii支原体感染乳腺组织而引发乳房炎的致病机理，为病因复杂的牛乳房炎的综合防治提供了有益的新资料。

3 Leachii支原体与犊牛肺炎

国外研究结果显示，leachii支原体可以在患肺炎犊牛的肺脏组织中分离获得[6]，但尚无其引起犊牛肺炎的直接证据。用1月龄犊牛作为实验动物，将leachii支原体体外培养物和感染犊牛的关节液分别通过关节内、静脉、气管内、滴鼻以及口服的途径接种犊牛，通过对所有接种犊牛的肺炎发病情况、肺组织病原学以及病理学检查，评价了leachii支原体对犊牛呼吸系统的致病性。结果显示，所有经关节内、静脉、气管内、滴鼻以及口服途径接种的犊牛均未表现临床肺炎症状，肺组织未呈现任何病理变化，通过免疫组化和PCR方法也均未在接种犊牛的肺组织中检测到leachii支原体[9]。结果表明，leachii支原体通过关节内、静脉、气管内、滴鼻以及口服等途径不能引起犊牛肺炎，推定leachii支原体至少不是犊牛肺炎的原发性病原。对收集于2010年至2017年的多份患肺炎牛的鼻拭子样品进行leachii支原体检测，发现只有在leachii支原体犊牛关节炎疫情发生的两年内(即2009和2010年)采集的少数样品中检测到leachii支原体，之后收集的鼻拭子样品中均未检测出leachii支原体[9,13]，间接证明了leachii支原体不是犊牛肺炎的主要致病因素。

4 Leachii支原体与孕牛流产

Hum等报道，在澳大利亚的一个大型奶牛场，有30%犊牛(240头)发生多发性关节炎，同场母牛同时发生乳房炎和流产，并且在犊牛关节液样品、乳汁样品以及流产胎儿的胃内容物和肺脏中分离出leachii支原体[7]。这是到目前为止唯一的有关leachii支原体与母牛流产相关的报道。在国内，尚未发现leachii支原体与母牛流产具有相关性的证据。因此，leachii支原体是否引起母牛流产，需要进行深入的调查研究。

5 Leachii支原体病的防控

本研究团队的研究结果显示，精液污染可以引起leachii支原体犊牛关节炎的集中暴发，破溃的关节通过关节液将大剂量病原排放到环境中，进而通过血液接触途径引起散发性犊牛关节炎、通过乳头管接触途径引起奶牛乳房炎，表明精液传播是leachii支原体病的主要传播途径。因此，建立可靠的病原学检测方法检测牛精液中的leachii支原体、以控制该病原通过精液而发生大规模传播，是leachii支原体病最为有效的防控手段。目前，本研究团队已经建立了leachii支原体PCR检测方法，该方法敏感性高、特异性强，可以对leachii支原体进行快速检测[13]。实际上，通过污染精液而传播的疾病很多，后续应该做更多的调查，将能够通过精液污染而传播的疾病列入精液检查的必检名录。目前我国对精液的检查仅包括活力和细菌数等方面的检查，病原检查有限。对精液进行病原检查，可以对有些牛疫病从源头进行控制，从而大幅减少经济损失。

6 结论及展望

综合本研究团队的近期研究以及国外的早期研究进展，leachii支原体的致病作用确定为：引起犊牛多发性关节炎和奶牛乳房炎，不引起犊牛肺炎，是否引起母牛流产有待进一步研究；leachii支原体的传播途径确定为：引起犊牛多发性关节炎仅通过血液的直接接触和污染的精液传播，引起奶牛乳房炎则通过乳头孔的直接接触进行传播。这些研究结果显示，leachii支原体的致病作用很强，但是传播途径和传播能力有限，纵向的病原学调查结果也间接证明leachii支原体的传播途径和能力是有限的[11,13]。目前，有关leachii支原体感染的致病机理尚不清楚。对其它支原体的研究显示，支原体对宿主细胞的直接粘附、细胞毒性以及免疫损伤，是支原体致病作用的主要机制[14-15]。因此，对leachii支原体的粘附蛋白进行筛选、并对其毒力基因进行鉴定，将有助于阐明其致病机理。本研究团队对leachii支原体的粘附蛋白进行了筛选和鉴定，并制备了针对粘附蛋白的单克隆抗体[16-17]，但详细的致病机制尚需深入的研究。