1例羊感染猪链球菌的诊断

许金蔓,高 尚,张信军,成大荣,王彦红,鞠辉明

(1.扬州大学兽医学院,江苏 扬州 225009;2.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州 225009)

猪链球菌病为急性败血性链球菌病,是由猪链球菌引起的感染性强、病死率高的一种热性传染病。猪链球菌是一种需氧或兼性厌氧革兰阳性菌,也是一种人兽共患病病原[1]。猪链球菌有着极高的致病性,除了易感动物猪外,牛、羊和人等哺乳类动物以及犬、猫、马等动物也能感染此菌[2-3]。其中羊感染此菌可通过消化道、皮肤损伤、脐带以及与带菌野猪接触等渠道感染,病菌可存在于泥土、灰尘、潮湿环境或者侵扰的草丛当中,由此增加羊感染此菌的机率。

猪链球菌病是世界各地规模化养猪场的常见疾病,大多数国家都有相关报道[4]。然而,有关羊感染此菌的,或感染后呈流行性趋势的案例,国内外仅有少数报道[5]。此次从两头死亡的山羊中分离到猪链球菌,并对其分子生物学特点进行研究。

1 发病情况与临床症状

2018年5月30日,扬州大学动物医院接到一例山羊陆续死亡的病例。主诉：共养了100只羊,发病的山羊数为10只以上,陆续死亡的有7到8只,死亡时山羊眼结膜充血,有透明的黏液性鼻液流出。剖检可见肺气肿、淤血,真胃有很多小点溃疡,肠系膜淋巴结肿大。

2 实验室检验

2.1 细菌分离 取病死羊的肺脏、肝脏,无菌接种于血琼脂平板。一组置于有氧条件下,另一组放入厌氧罐中并加入厌氧反应袋,于37℃条件下培养24 h,观察结果。24 h后于无菌条件下挑取血琼脂平板上不同形态的菌落接种于新的血液琼脂平板上,于37℃条件下培养24 h,再挑取单个菌落进行革兰染色,镜检。

2.2 生化试验 采用链球菌细菌生化编码鉴定管对分离得到的菌株进行生化指标的鉴定。在37℃条件下培养24 h,观察结果。

2.3 16S rDNA鉴定 按照16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法操作,通过煮沸法进行DNA模板的制备,引物通过生物公司合成,紧接着做PCR鉴定,将PCR的产物进行凝胶电泳试验。

2.4 小鼠攻毒试验 购自扬州大学兽医学院比较医学中心的6周龄小鼠4只,雌雄各半,分为两组。一组采用攻毒处理,一组作为对照组。试验组小鼠采用腹腔注射处理,剂量均为0.1 mL菌液,菌液浓度为1.5×108CFU/mL,对照组小鼠腹腔注射0.1 mL生理盐水。给予相同的鼠粮和水源,饲养观察。对死亡小鼠的肺、脾、肝、肾制作病理切片,观察其病理变化。

2.5 药敏试验 采用纸片琼脂扩散法进行药敏试验,将分离菌培养物均匀涂布于血平板上,无菌取药敏片贴于平板上,37℃培养24 h后,测定抑菌圈直径。药敏结果判定按照杭州天和微生物试剂有限公司发布的标准进行。

3 结果

3.1 细菌分离 取病死羊肺脏、肝脏组织在无菌条件下接种于血琼脂平板上,37℃培养24 h后,血琼脂平板中长出散在的淡灰色、透明隆起,边缘整齐的露珠样小菌落,菌落周围呈现溶血现象。经过纯化培养后,镜检可见菌株是革兰阳性菌,呈单个或双链状排列,有些呈短链状排列(见中插彩版图1)。

3.2 生化试验结果 本菌生化鉴定结果表明,本菌可以发酵鼠李糖、葡萄糖、果糖,分解精氨酸、七叶苷,不能分解山梨醇,符合猪链球菌的生化培养特点。

3.3 16S rDNA鉴定结果 PCR产物经1%琼脂糖凝胶电脉,得到大小为500 bp左右的目的条带,随之将扩增产物寄往生物公司进行测序,所得的序列与数据库中猪链球菌AF009501.1为100%符合,测得的细菌为猪链球菌。

3.4 小鼠攻毒试验结果 饲养24 h后,试验组全部死亡,对照组小鼠精神正常。对死亡的小鼠进行病理解剖发现肺脏、肝脏、脾脏出血,胸腔出血严重。采取肺脏,无菌接种在绵羊血琼脂上,于37℃培养24 h,观察可见平皿上长出淡灰色、湿润透明、针尖大小的小菌落,与分离菌菌落形态一致。采取肺脏切面,制作肺触片,进行革兰染色,于显微镜下观察可见大量蓝紫色,短链状球菌,与分离菌镜检形态一致。病理变化主要是死亡小鼠肝脏中肝索紊乱,肝细胞肿胀、溶解(见中插彩版图2),肾脏肾小球结构不全,被破坏(见中插彩版图3)。

3.5 药敏试验结果 药敏试验结果表明,本菌对美洛西林、头孢哌酮极度敏感;对氟苯尼考、左氧氟沙星、丁胺卡那霉素等中度敏感;对卡那霉素、多黏菌素B等耐药。

4 诊断与小结

从送检病死羊的病料中分离出一株细菌,其菌落形态、需氧或兼性厌氧特性、生化特性与猪链球菌相似,结合PCR鉴定分析可知分离菌为猪链球菌。综上所述,送检病死羊感染猪链球菌。

药敏试验结果显示,分离菌对链霉素等耐药,对头孢哌酮,美洛西林等很敏感,这与文献[6]记载结果一致。在临床疾病防治过程中,要想取得较好的治疗效果应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验,根据药敏试验结果,选择敏感药物,且注意交替用药,这样才能达到更好的治疗效果[7]。

从病死羊分离出猪链球菌,这对羊感染猪链球菌疾病的诊断和治疗具有重要的意义。在平常的饲养当中,养殖户需做好畜禽的卫生防疫工作,加强饲养管理,做到早预防,早诊断,早治疗[8-9],尽可能地将养殖场经济损失降到最低,以及重点关注场内人员直接接触畜禽的皮肤保护,避免吃生肉或未熟肉,提高自我保护意识[9]。