长链非编码RNA及其与人类疾病之间关系的研究概述

汪显坤 林欣娅 胡雪峰

(福建师范大学生命科学学院 福州 350108)

1 长链非编码RNA简介

2002年，日本科学家Okazaki在对小鼠cDNA文库大规模测序时第一次发现了一类较长的转录产物，并将其命名为长链非编码RNA(Long non-coding RNA， lncRNA)[1]。lncRNA是一类长度为200～10 000 nt之间的非编码RNA。研究表明，人类许多疾病的发生都涉及到lncRNA的过度表达、缺失或突变；另一方面，lncRNA能在X染色体失活、染色质修饰、干细胞定向分化以及转录沉默、激活等重要生物学过程中施加影响。

1.1 lncRNA的种类 根据与编码蛋白基因的位置关系，lncRNA分为以下几种： ①反义lncRNA(antisense lncRNA),由编码蛋白基因的反义链(模板链)转录而成；②正义lncRNA(sense lncRNA),由编码蛋白基因的正义链(非编码链)转录而成；③内含子lncRNA(intronic lncRNA),完全由基因的内含子区域编码而成；④基因区间lncRNA(large intergenic noncoding RNA, lincRNA),由两个基因之间的区域编码而成，因此不与编码基因的内含子和外显子相重叠；⑤反义上游lncRNA(antisense ustream lncRNA),其序列位于反义链上游,编码基因的启动子为双向启动子，采用与编码基因转录的反方向进行转录，因而与编码基因头对头相邻；⑥增强lncRNA(enhancer lncRNA)，由基因的增强子转录而成的，可以促进基因转录[2]。

1.2 lncRNA的产生方式 lncRNA有以下产生方式： ①编码基因的发生框插入一段序列，进而破坏原有的编码功能，转录成一个与先前编码序列合并的lncRNA；②染色质在发生重排后，两个不转录并且间隔距离很远的序列区合并到了一起，产生了一个含多个外显子的lncRNA；③在两次连续的重复时间内，ncRNA内部产生相邻的重复序列以增加ncRNA的核酸数，从而产生lncRNA；④通过转座因子的自由插入产生一个有功能的lncRNA；⑤非编码基因通过反转录转座作用复制，产生一个有功能的非编码逆转录基因，或产生一个无功能的逆转录基因。

1.3 lncRNA的结构和功能特点 在人类基因组中约有70%的基因被转录成RNA，但只有2%左右的RNA编码蛋白质的合成。与mRNA相同，lncRNA也是由对应的基因转录而成，具有5′帽子、poly(A)尾巴和启动子结构，通过前体的适当剪接，便可形成成熟体的lncRNA；同一基因可以形成不同的转录本的lncRNA。然而，与miRNA相比lncRNA具有相对较长的核苷酸链，在发挥作用时既可以与DNA杂交来调控基因的表达，也可与mRNA结合来调控转录；更重要的是，它能够通过空间的盘曲，折叠成许多特定而复杂的二级结构，这些独特的空间结构能够提供分子结合位点，从而使其可以行使特定的生物学功能。

2 lncRNA与人类疾病

2.1 lncRNA与癌症 主要介绍lncRNA与肝癌、肺癌、胃癌和乳腺癌之间的关系。

2.1.1 肝癌 肝癌是常见的癌症，具有转移发生率高以及术后复发率高的特点。lncRNA具有与微小RNA(micro RNA, miRNA)竞争性结合、从而使mRNA正常表达的功能。miRNA是一类序列小于200 nt的非编码RNA，可以与靶mRNA通过碱基互补配对结合，从而抑制mRNA的表达[3]。在肝癌的研究中发现，名为miR-372的mRNA与cAMP依赖蛋白激酶(PRKACB)的mRNA 3’非编码区有相同靶点，从而抑制PRKACB基因的表达。肝癌高表达转录本(HULC)在肺癌组织中高水平表达，而lncRNA-HULC作为一种内源性的“海绵”可以竞争性地抑制miR-372的活性，进而上调靶基因PRKACB的表达，诱导磷腺苷效应原件结合蛋白(CREB)的磷酸化。磷酸化的CREB会结合到HULC基因的近端启动子区域，促进RNA聚合酶Ⅱ与染色质的结合，进而激活致癌基因HCLU的转录[4]。这是一种正反馈的调节机制。根据以上的调节机制，lncRNA-HULC可以作为早期肝癌预测与诊断的标志物。

在研究间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)对肝癌发生的作用时，发现一些lncRNA异常表达，并鉴定出一种在肝癌组织中高表达、名为lncRNA-MUF的、新的lncRNA。研究表明lncRNA-MUF可以结合膜联蛋白A2(annexin A2, ANXA2)，进而激活Wnt/β-连环蛋白信号通路(Wnt/β-catenin)和上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，而EMT可以减少肿瘤细胞的凋亡与衰老，增强耐药性[5]。同样lncRNA-MUF也可以作为miR-34a的竞争性内源RNA，导致转录因子Snail1上调和EMT活化。

2.1.2 肺癌 肺癌主要分为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)，其中，NSCLC的发病率占总数的85%。在NSCLC中，lncRNA-MEG3(maternally expressed gene 3)通过多条信号通路发挥作用： 在p53通路中，p53抑癌基因是MEG3的下游靶点，MEG3与癌基因(murine double minute2, MDM2)作用，阻碍MDM2对p53蛋白的泛素化降解，从而活化p53，抑制癌细胞生长；在Rb通路中，Rb的活化可以下调DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1, Dnmt1)的表达，降低MEG3基因及其附近DNA的甲基化水平使MEG3高表达，从而抑制癌细胞的增殖[6]、调节血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和跨膜受体蛋白(Notch)的信号通路。

lncRNA会影响前体mRNA(pre-mRNA)的可变剪接。研究表明，肺腺癌转移相关转录本1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1)是一条长度为8 708 nt的lncRNA，它与癌症的发生和发展有着密切的关系。研究发现，MALAT1能够招募丝氨酸/精氨酸结合SR(serine/argine)蛋白剪接因子，通过控制SR蛋白的富集方式，调节其在细胞核内的分布和活性，从而影响一些pre-mRNA的可变剪接。近年来，不断有新的lncRNA被发现并被证实与肺癌的发生与迁移有着重要的关系。例如，李雪萍等[7]发现lncRNA-LOC90024与肺癌的发生密切相关，当过表达LOC90024时，可显著促进肺癌细胞生长和迁移。因此，lncRNA-LOC90024可能作为癌基因发挥作用，有望提供新的治疗靶点。

2.1.3 胃癌 我国胃癌的发病率和死亡率高居世界第二。lncRNA-H19可促进细胞增殖。例如，在人胃腺癌AGS细胞系中上调H19基因后，癌细胞增殖明显增加，而沉默H19基因后，癌细胞呈现持续凋亡的状态。其调节机制涉及H19/ISM1和miR-675/CALNI两条通路，当过表达H19基因时，一方面使ISM1上调，呈正相关，另一方面通过miR-675抑制CALN1的表达，促进癌细胞的增殖与转移[8]。除了通过多条信号通路来调节之外，也可通过lncRNA与靶mRNA结合来调节。胃癌高表达转录本1(gastric carcinoma proliferation enhancing transcript 1, GHET1)是与胃癌发生、发展、迁移密切相关的lncRNA。GHET1与胰岛素样生长因子mRNA结合蛋白1(insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1, IGF2BP1)结合，IGF2BP1再作用于癌基因c-Myc mRNA，使c-Myc mRNA维持稳定并提高表达水平[9]。而c-Myc的表达产物使细胞无限增殖，并且可调节细胞的恶性转化，是早期发现的一种重要的癌基因。

2.1.4 乳腺癌 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率都高居女性癌症的首位，严重影响女性的健康生活。lncRNA调控着乳腺癌的发生和转移。人们对生长阻滞特异转录本5(GAS5)研究最为深入，在乳腺癌中，GAS5基因是Notch-1信号传导通路中的下游靶点。研究表明，当干扰Notch-1时，乳腺癌细胞中的GAS5基因的转录水平可显著提高，从而诱导癌细胞的凋亡和生长阻滞[10]，GAS5和miR-21还存在着相互抑制、双向调控的机制，以促进癌细胞的生长[11]。GAS5可靶向糖皮质激素受体(GR)的DNA结合区，阻碍受体和下游蛋白的表达，影响细胞的增殖和代谢。基于以上机制，GAS5可作为手术预后评估的重要标志物。除此之外，lncRNA ANRIL的基因在肺癌、肝癌、乳腺癌等恶性肿瘤的组织中也高水平表达，充当原癌基因的作用。在乳腺癌细胞系MCF7细胞的研究中发现，ANRIL可能通过与PRC2的核心亚基——多梳蛋白SUZ12相互作用，介导组蛋白的甲基化，沉默p15基因的转录，当ANRIL基因沉默时，干扰SUZ12与p15的结合，从而促进p15的表达，并进一步促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭[12]。ANRIL还可通过相同的机制来沉默p53基因。

2.2 lncRNA与心血管疾病 心血管疾病常常伴有心肌增厚、心力衰竭、心肌梗死等症状，而lncRNA与心肌细胞的分化密切关系，因此也在疾病的发生中发挥着重要的作用。研究发现，在血管紧张素(AngII)诱导的人心肌增厚的模型中，心肌增厚相关因子(cardiac hypertrophy related factor, CHRF)高水平表达，lncRNA-CHRF干扰miR-487，抑制其与髓样分化因子88(Myd88)的结合，而Myd88介导下游转录因子NF-kB[13]，参与心肌增厚的信号传导，结果导致心肌细胞的肥大。

Greco等[14]在对照非终末期心力衰竭病人与健康组成人的左心室心肌细胞时，发现有9种lncRNA(CDKN2B-AS1/ANRIL、 EGOT、 H19、 HOTAIR、 LOC285194/TUSC7、 RMRP、 RNY5、 SOX2-OT和SRA1)在非终末期的调节水平与终末期一致，且都表达下调。另外，在心血管疾病中，心肌梗死因为部分心肌细胞的急性缺血而对患者造成严重的威胁。Zangrando等[15]曾发现并命名了心肌梗死相关转录物lncRNA-MIRT。他利用原位杂交技术，基因间lncRNA-MIRT被定位在心肌梗死模型鼠的左心室，并且MIRT1和MIRT2的表达水平的分别提高了5倍和13倍。进一步研究发现，MIRT的剂量与射血分数正相关，而与梗死面积负相关。

2.3 lncRNA与神经退行性疾病 lncRNA可调控神经干细胞(neural stem cell, NSCs)的定向分化。NSCs具有可分化成神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的潜能，而一些lncRNA在中枢神经系统的表达具有细胞和组织的特异性。研究发现，Dlx5/6基因间的增强子转录形成3.8 kb的lncRNA Evf-2，通过与Dlx-2结合并使后者活化，招募CpG甲基结合蛋白2(methyl CpG binding protein 2， MECP2)、DLX等转录因子与Dlx5/6基因结合，提高Dlx5/6的表达，是促进NSCs向γ-氨基丁酸神经元分化的关键因子[16]。研究还发现，lncRNA-RMST、 lncRNA-N1、 lncRNA-N2和lncRNA-N3能通过结合表观沉默蛋白SUZ12和神经元限制性沉默因子(neuron-restrictive silencer factor, NRSF)，激活下游通路而促进NSCs向神经元分化，为研究NSCs定向诱导成多巴胺能神经元、并用以治疗帕金森病提供了理论依据。

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease, AD)是严重影响生活质量、且发病率较高的神经退行性疾病。其发病的机制之一是β分泌酶1(β-site of APP cleaving enzyme 1, BACE1)能够使淀粉样蛋白前体(amyloid precursor protein, APP)断裂而产生突触毒性物质Aβ，Aβ42大量累积形成大脑皮质老年斑。而BACE1的反义转录物BACE1-AS可以缓解这一过程,这是明显的反馈—应激的机制。Liu等人[17]利用siRNA技术沉默了AD老年斑lncRNA BACE1-AS的表达，结果表明BACE1的异常剪切APP的能力明显下降，Aβ42的生成量也随之减少。由此推测，lncRNA BACE1-AS可能是形成Aβ的关键因子。

2.4 lncRNA与自身免疫疾病 自身免疫疾病常包括系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis， RA)、I-型糖尿病(type 1 diabetes mellitus， T1DM)、银屑病(psoriasis)等，这些疾病的致病机理大致相同，而SLE、 RA等常伴随着慢性的关节炎症反应。SLE是一类先天性免疫和获得性免疫共同调控的复杂免疫疾病。lncRNA-Gas5可能通过竞争性结合GR而阻断GR下游信号的转导[10]，当GAS5表达量提高时，则会削弱糖皮质激素对SLE患者的治疗。lncRNA-NFAT1在SLE患者外周血的单核细胞中浓度较高，这主要与炎症反应密切相关。Zhang等[18]的研究发现，NFAT1的表达可激活p38/MAPK通路，从而导致白介素-6(IL-6)、趋化因子-10(CXCL-10)等炎症因子的大量聚集。

RA的临床表现主要为手足等关节的僵硬、畸形，异常表达的lncRNA主要存在于RA患者的外周血和关节滑液中。Song等[19]利用微矩阵技术，发现至少有Hotair、 LUST和MEG9等七种lncRNA在RA患者体的内表达上调。同时高剂量的Hotair活化巨噬细胞，低剂量的Hotair却激活MMP-2、 MMP-3等基质蛋白酶，lncRNA可能作为有效诊断RA的标志物。在小鼠胰腺癌细胞(MIN6)中表达大量的lncRNAs，这些lncRNA被定位在胰岛，并且在非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)的患病前期高水平表达。其中的lncRNA-3和lncRNA-4能够跟肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白介素-61β(IL-1β)等炎症因子共同调节胰岛细胞的凋亡[20]。

3 结语

lncRNA在发挥其功能的过程中，与各种疾病的发生与迁移有着密切的联系，这已经成为近年来疾病机制研究的重点领域，而对lncRNA的结构与功能的深入了解，则有望为疾病的治疗提供新的思路。