外泌体microRNAs作为心血管疾病生物标志物的研究进展

袁近松 石蓓

(遵义医学院附属医院心血管内科，贵州 遵义 563000)

心血管疾病诊断的生物标志物主要是对已知心肌蛋白的靶向分析和对心血管疾病的诊断变得越来越重要。肌酸激酶同工酶、肌红蛋白及肌钙蛋白等生物标志物目前已被广泛应用于临床，且肌钙蛋白被认为是急性心肌梗死诊断的金标准，但对其他心血管疾病的诊断缺乏特异性。外泌体的成分和生物学内容物对细胞激活和损伤具有特异性，它们具有作为心血管疾病诊断和预后生物标志物的潜力。由于外泌体miRNAs具有组织特异性，并且能在相关体液中检测，自发现以来就不断引起大多数研究者的兴趣。近年来研究发现外泌体miRNAs参与心血管疾病的生理和病理机制及外泌体miRNAs的临床应用已成为心血管疾病诊断研究的前沿和热点。本文主要讨论外泌体和外泌体miRNAs作为心血管疾病诊断性生物标志物的研究进展。

1 外泌体的生物学特性及功能

外泌体是一种脂质双分子结构的囊状小泡，直径30～100 nm，来源于多泡体的内部囊泡，Johnstone等〔1〕于20世纪80年代晚期在成熟的羊网状红细胞中首次发现。外泌体最初被认为是细胞碎片而很少受到关注，研究发现这些细胞碎片并不是网织红细胞特有，而是由大多数哺乳动物细胞所释放，此后研究发现包括干细胞、内皮细胞、成纤维细胞和肿瘤细胞等大多数细胞都可以产生外泌体〔2〕，并广泛存在于人体血液、尿液、唾液、乳汁、支气管肺泡灌洗液、精液、羊膜液、腹水、关节液及脑脊液等体液中〔2～4〕。外泌体中包含蛋白质、脂质、DNA、mRNAs和miRNAs等携带生物信息的多种生物活性分子，可通过蛋白免疫印迹法、流式细胞术对其进行鉴定。根据细胞来源的不同，外泌体有免疫调节、细胞迁移、细胞分化及介导细胞间交流等不同的生理功能。

ExoCarta作为研究外泌体的常用数据库，涵盖了蛋白、外泌体miRNAs、mRNAs等最新进展，外泌体有一个复杂成分，其分子内容物取决其细胞来源。其中有4 563种蛋白质、194种脂质、1 639种mRNAs和764种miRNAs在不同物种中发现外泌体，最常检测到的有膜结合蛋白和膜融合蛋白〔5〕。外泌体的常用蛋白包括四跨膜蛋白、CD63、CD81、CD9和热休克蛋白70等，这些蛋白质常作为外泌体标记物〔6〕。外泌体富含胆固醇、磷脂、磷脂酰丝氨酸和前列腺素等脂质，然而缺乏细胞核、线粒体和核糖体蛋白，但包含有最重要的mRNAs和miRNAs。外泌体在体液中高度稳定，因此，可以通过获得分子内容物提供大量原始细胞生理和病理状态下信息。

目前国内外已开展了外泌体在肿瘤、神经系统疾病、心血管疾病及肝病等多个领域诊断的研究。外泌体能通过血脑屏障作用于远处组织，它们与靶细胞的质膜融合转染其内容物。由于供体细胞介导细胞间传递信息的特征和能力，体液中外泌体的数量和内容物可能受疾病的影响而明显改变，因此外泌体被视为疾病诊断的生物标志物。总之，外泌体内容物的检测可用于各种疾病的早期诊断。自从2007年Gupta等〔7〕在体外培养的心肌细胞中分离出外泌体，后来研究发现外泌体可由多种心脏细胞分泌，包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、心脏祖细胞和心脏干细胞，自此以后外泌体在心血管疾病的研究引起大多数研究者的兴趣。由于外泌体介导心脏细胞间传递信息的作用，临床应用作为心血管疾病诊断性的生物标志物。

2 外泌体miRNAs

miRNAs是短链非编码RNAs，调节转录后水平的基因表达〔8〕，广泛参与细胞分化、生长及增殖凋亡等生命活动，同时参与心血管疾病的发生发展过程，因此在心血管疾病的发病机制方面扮演着重要的作用。虽然miRNAs的生物学功能不是很清楚，但有些miRNAs以组织和细胞特异性的方式存在。miRNAs存在于人体血液中，其特异性表达与疾病的诊断和预后有关。心脏特异性miRNAs在心血管疾病中释放入血液循环，可用于心肌损伤的监测。心血管疾病患者血浆中miRNAs水平变化可作为研究心血管疾病潜在的生物标志物。

研究发现循环中miRNAs是稳定的，但在许多生理和病理条件下，可以改变其表达扩增，成为非侵入性临床诊断的生物标志物〔9～11〕，且miRNAs的异常表达扩增与心血管疾病的发生发展有关。De Gonzalo-Calvo等〔12〕研究发现miRNAs是早期监测心肌活力、结构和功能变化具有敏感性、特异性和非侵入性的生物标记物。外泌体分离纯化提高了人类体液miRNAs扩增度的灵敏性，外泌体miRNAs是早期生物标记物研究的起点，同时减少miRNAs扩增出现阴性结果的可能性。成熟miRNAs占外泌体所有RNAs的41.72%〔13〕。Gallo等〔14〕研究证实外泌体是miRNAs的富集体，可作为miRNAs研究的可靠载体。

在不同微环境刺激下，心肌组织分泌外泌体，参与心脏细胞间传递信息，同时心脏细胞能主动、特异性地包裹miRNAs，并通过外泌体的形式分泌到细胞外环境响应不同的刺激。Stoorvogel〔15〕研究证实外泌体转运miRNAs的过程如下：①miRNAs选择性地包裹入多泡体囊腔内；②多泡体与质膜融合，将细胞内囊泡分泌到细胞外环境；③外泌体可与靶细胞的质膜直接融合；④外泌体先被靶细胞内吞，再于内体胞膜融合；⑤外泌体通过上述两种途径将miRNAs传递到靶细胞胞质中，可与相应的mRNAs发挥作用。

有研究通过基因芯片分析发现人血清外泌体中心脏源性miRNAs的表达谱，发现其中心脏表达的miRNAs有miRNA-192，miRNA-194，miRNA-32a〔16〕，miRNA-1，miRNA-133a〔17〕，miRNA-146a〔18〕，miRNA-423-5p，miRNA-320，miRNA-22，和miRNA-92b〔19〕等。心脏细胞起源不同的外泌体中所含的miRNAs具有不同的生物学特性和靶向特异性，其表达水平与疾病的发生发展密切相关。

3 外泌体miRNAs作为心血管疾病的生物标志物

循环中外泌体miRNAs作为急性心肌梗死、慢性心力衰竭和冠状动脉疾病等心血管疾病新的诊断性生物标志物有很好的研究前景。循环无细胞miRNAs在体液中非常稳定。事实上，miRNAs对RNA酶活性有抵抗作用。循环miRNAs通过包裹入囊泡中免受血浆RNA酶活性的影响。但循环中90% miRNAs与核糖核酸蛋白复合物都以非膜结合的形式存在，这些无囊泡结构的miRNAs通过蛋白酶K消化使其不稳定，这说明循环miRNAs稳定性受蛋白酶复合物保护，使其免受富含RNA酶活性的影响。Arroyo等〔20〕研究发现蛋白酶敏感的复合物对循环miRNAs稳定性具有保护作用。Vickers等〔21〕验证了miRNAs通过高密度脂蛋白在血浆中运输并转运到受体细胞的机制。外泌体脂质双分子层内包裹入miRNAs通过体液保护使其免受酶的降解，从而形成相对较长和稳定的表达时间。靶细胞传递的外泌体miRNAs能显著影响供体或受体细胞内的生物通路，从而导致细胞功能的改变和病理状态的发展。外泌体miRNAs在体液中的生物特性及对供体或受体细胞的靶向特异性。因此，外泌体miRNAs将作为心血管疾病生物标志物研究的前沿和热点。

3.1外泌体miRNAs与冠状动脉疾病 循环miRNAs可作为急性心肌梗死潜在的诊断性生物标志物〔22～25〕。心肌损伤后miRNAs从心脏释放入循环系统。De Rosa等〔26〕测量7例健康对照组、31例稳定性冠心病和19例肌钙蛋白敏感型急性冠脉综合征患者主动脉和冠状静脉窦血样中循环miRNAs水平发现，肌钙蛋白敏感型急性冠脉综合征患者冠状动脉循环miR-499，miR-133a和miR-208水平明显升高，表明这些miRNAs在心肌损伤后释放入冠状动脉循环。其他独立研究证实，急性心肌梗死患者血液中富含miRNA-133，miRNA-208和miRNA-499水平提高〔27～30〕，这也支持miRNAs作为血源性生物标志物在心血管疾病领域研究有广泛应用前景。

Kuwabara等〔17〕在29例急性冠脉综合征患者和42例健康对照组中研究发现，与健康对照组相比，急性冠脉综合征患者血浆miRNA-1和miRNA-133a水平过表达。他们进一步研究证实在钙离子A23187治疗后心脏H9C2细胞释放的外泌体中发现miRNA-133a表达，这表明通过有活性的外泌体分泌的miRNA-133a释放到血液循环。这使得循环外泌体miRNAs是急性冠脉综合征非侵入性生物标志物，用于急性冠脉综合征的早期诊断。

3.2外泌体miRNAs与心力衰竭 Matsumoto等〔16〕在一个小规模研究中使用TaqMan技术分析人类miRNAs，在纳入的心力衰竭患者中研究一组377种miRNAs，然后在21例患者的验证实验中发现这些miRNAs。在心肌梗死后随访过程中出现心力衰竭临床表现的患者血浆p53反应性的miRNA-192，miRNA-194和 miRNA-34a水平显著上调。有趣的是miRNA-192，miRNA-194和miRNA-34a主要存在于血浆外泌体，这研究表明，特异性外泌体miRNAs可作为心肌梗死后心力衰竭潜在的生物标志物。

为了验证血浆miRNAs在预测心力衰竭预后方面的作用，Goren等〔19〕在一组健康和心力衰竭患者血浆样本中完成370种miRNAs基因芯片扩增分析，然后通过定量的PCR验证，他们研究发现，心力衰竭患者循环中miRNA-423-5p，miRNA-320a，miRNA-22和miRNA-92b等4种miRNAs可检测和显著调节。令研究者感兴趣的是，这些被选择的miRNAs在数量上与心力衰竭的临床和预后指标有关。通过对血浆4种miRNAs的累积定量测量可准确的识别心力衰竭，其准确度比任何单独测量的miRNA高。最后，Goren等〔19〕在10例心力衰竭患者和10例健康对照组血浆外泌体和非外泌体miRNA表达水平中研究发现，在心力衰竭组和对照组的外泌体和未分离血清中miRNA-423-5p，miRNA-320a和miRNA-22表达水平无显著差异。然而，在心力衰竭组外泌体miRNA-92b水平减少。这使得外泌体miRNAs作为心力衰竭非侵入性的生物标志物，并用于心力衰竭的早期诊断、治疗和评估预后。

3.3外泌体miRNAs与围生期心肌病 研究证实miRNA-146a可作为围生期心肌病潜在的治疗靶点〔18〕。Halkein等〔18〕为了验证外泌体miRNA-146a是否可作为围生期心肌病诊断的生物标志物，研究发现，与产后健康妇女和扩张型心肌病患者相比，急性围生期心肌病患者循环外泌体miRNA-146a水平显著升高。随后Halkein等〔18〕进一步研究发现，围生期心肌病患者接受心力衰竭标准化治疗后外泌体分泌的miRNA-146a减少。经上述研究证实循环外泌体miRNA-146a可作为围生期心肌病早期诊断、治疗靶点和评估预后的生物标志物。

4 小结及展望

外泌体作为细胞间传递信息的载体，其在急性冠脉综合征、心力衰竭、冠状动脉疾病、围生期心肌病、急性病毒性心肌炎及心房颤动等方面已有初步研究。作为纳米级的生物膜结构，外泌体能顺利通过血脑屏障并避免机体的免疫排斥，同时较好地保证了内容物的完整性及生物活性，这些优势极大地提升了外泌体应用于心血管疾病临床诊断的可行性。随着研究的不断深入，外泌体miRNAs通过调节不同心脏细胞类型的细胞间交流在心血管疾病的发生发展过程中起着重要的作用。外泌体miRNAs作为心血管疾病潜在的生物标志物和干细胞治疗为将来临床应用取得了重要的进展。外泌体miRNAs在心血管疾病应用和靶向治疗有广泛的研究前景。今后外泌体miRNAs在心血管疾病的研究可以从以下几方面进行：①探索外泌体与心血管疾病相关miRNAs的种类及生物特性；②以外泌体miRNAs为突破点，构建靶基因-靶miRNAs-蛋白通路，从基因及蛋白层面揭示心血管疾病的发病机制；③将外泌体作为miRNAs的转染载体，从而精密地调控靶蛋白的表达水平，作为心血管疾病新的诊断性生物标志物，有利于心血管疾病的早期诊断、早期治疗及改善预后。