苜蓿黄酮的生物活性功能及其在反刍动物中的应用

李苗苗， 靳思玉， 牛志力， 曹 阳

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

紫花苜蓿在世界各地广泛种植，不仅可作为草食家畜的高蛋白粗饲料，还因富含生物活性次级代谢产物在诸多领域（医学、美容、农业等）备受青睐（Gawel'等，2017； Cornara 等，2016）。 紫花苜蓿次级代谢产物包含大量的黄酮类化合物，目前提取到的黄酮类化合物有50余种（Katarzyna等，2016），干物质基础上测得总含量达到 （12.6±0.17）mg/g（Karimi等，2013）。提取纯化后的黄酮添加到动物基础日粮中，在机体内充当自由基清除剂和金属螯合剂（Oskoueian等，2014），发挥杀菌、抗氧化、抗病毒、增强免疫力、调节心血管等功能（Liu 等，2018；Martínez等，2016）。 本文着重对苜蓿黄酮的生物活性和提取工艺进行阐述，同时简要的分析造成苜蓿黄酮含量差异的因素，旨在为苜蓿黄酮类化合物在畜牧生产上的利用提供理论参考依据。

1 黄酮类化合物分类

根据C3结构氧化程度和B环连接位置的不同，黄酮类化合物主要分为黄酮及其苷类、异黄酮类、异黄烷及其苷类、紫檀烷类、二氢黄酮类、查耳酮类等（Katarzyna等，2016）。黄酮及其苷类的糖基部分主要以葡萄糖或葡萄糖醛酸为主，包含芦丁、芹菜素、木犀草素、金圣草黄素、苜蓿素、麦黄酮等；异黄酮类主要有芒柄花苷、染料木黄酮、大豆黄素、苜蓿内酯、鸡豆黄素A、考迈斯托醇等，该类物质具有类雌激素样作用；异黄烷及其苷类主要有柚皮素、圣草酚、蒜头素、维斯体素等；紫檀烷类主要有美迪紫檀素等；查耳酮类主要有异甘草素、甘草素等（赵娅敏等，2103）。苜蓿中最常用的黄酮类化合物主要为芹菜素、木犀草素、苜蓿素。

2 苜蓿黄酮的生物活性功能

2.1 杀菌作用 畜牧生产中抗生素的长期不规范使用导致动物产品抗生素残留成为亟待解决的问题，开发“天然、绿色”抗菌剂成为研究热点，黄酮类化合物已被证实具有一定的抑菌作用 （Babii等，2018）。黄酮类化合物主要通过抑制菌体内能量生成（抑制需氧菌糖代谢来抑制三羧酸循环、阻碍病原菌能量摄取、破坏细胞完整性、增加细胞通透性）、抑制菌体内酶活性（抑制拓扑异构酶活性、抑制还原酶/脱氢酶活性）、抑制蛋白质核酸合成等来发挥杀菌作用（杨彩霞等，2014）。通过对提取的苜蓿黄酮进行抑菌试验发现，其对大肠埃希氏杆菌的最小抑菌浓度（MIC）值为0.40 mg/g，对金黄色葡萄球菌MIC值为0.70 mg/g（董晓宁等，2014）。对7种苜蓿的水醇提取物进行检测发现，黄酮类化合物含量为5.54～11.67 mg/g，抗微生物潜力的初步测定表明，苜蓿提取物显示出抗菌活性，对于部分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，MIC值分别为31.3 μg/mL 和 125 μg/mL（Rodrigues等，2013）。

2.2 抗氧化作用 紫花苜蓿中含有丰富的黄酮类化合物，其可通过抑制自由基产生和清除自由基反应发挥良好的抗氧化特性。随着苜蓿黄酮质量浓度增加，其对DPPH自由基的清除速率逐渐增大，当苜蓿黄酮质量分数为1.78 mg/mL时，对DPPH自由基清除率可达到50%；同时通过铁还原抗氧化能力的方法得出，随着黄酮浓度增加，Fe2+-TPTZ复合体形成量增加，表现出的铁还原能力越强，总黄酮质量浓度与铁还原抗氧化能力呈线性相关，R2=0.9675（刘香萍等，2016）。苜蓿黄酮还具有激活机体抗氧化体系的功能，其可通过增强抗氧化酶活性，提高抗氧化因子合成，激活机体内固有的抗氧化程序，发挥自身抗氧化作用。当机体内氧自由基的产生和清除失衡，过量活性氧的产生和积累导致神经元产生损伤时，抗氧化剂黄酮类化合物也能通过保护神经元细胞免受氧化应激诱导的损伤来发挥抗氧化作用（Xu等，2017）。

2.3 抗肿瘤作用 黄酮类化合物可通过诱导凋亡信号通路的激活，干预凋亡信号传导途径，参与细胞周期蛋白调控的方式，诱导肿瘤细胞增殖和凋亡的发生 （Gatouillat等，2014）。人胃癌细胞MGC-803体外培养时加入苜蓿黄酮，发现其可通过下调周期蛋白CyclinD1、CDK4、CDK6的表达，引起细胞周期紊乱，使细胞阻滞在G0/G1期，抑制细胞增殖；然后通过活化促凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3、PARP， 抑制凋亡蛋白 Bcl-2 的表达，诱导细胞凋亡，且这种抑制作用存在着时间和剂量依赖效应（左晓昕等，2016）。黄酮类化合物还可以通过增加胞内Ca2+水平，降低细胞内线粒体膜电位，促进线粒体释放凋亡诱导因子移位到细胞核发挥凋亡效应（王艳芳等，2003）。

2.4 脂类代谢 食物中脂肪的消化和吸收需要脂肪酶的参与，胰脂肪酶占脂肪分解活性的50% ～70%，而胃脂肪酶占10%～30%，肠道中的三酰甘油被脂肪酶水解转化为单甘油和脂肪酸后被机体吸收代谢（Birari等，2007）。黄酮类化合物可通过抑制脂肪酶活性减少脂肪分解，降低机体的吸收，阻止肥胖疾病发生。同时也发现脂肪酶活性的抑制与附着于C3位的酰基链长度存在直接关系（R2=0.91）（Gonzales等，2015）。

2.5 类雌激素样作用 含有杂环酚羟基结构的植物雌激素因相似于机体内雌激素结构，能结合体内雌激素受体，发挥较弱的雌激素样作用。如大豆黄酮和染料木素等均能调节动物体内生长激素、胰岛素样生长因子等激素的分泌，促进动物组织、器官发育；还可以调节垂体促黄体素和促卵泡素等性激素的合成和分泌来影响动物的繁殖性能 （Collins-Burow等，2012）。苜蓿黄酮灌胃性未成熟的雌性大鼠和成年大鼠，在性未成熟的雌性大鼠中，高剂量组促性腺激素释放激素降低，促卵泡生成素受体的表达量提高，低剂量组黄体生成素和芳香化酶（CYP19A-1）的表达量提高；苜蓿黄酮能降低促成年大鼠中性腺激素释放激素的表达量，提高促黄体生成素受体和CYP19A-1的表达量。苜蓿黄酮可通过下丘脑-垂体-卵巢性腺轴产生负反馈调节，并通过负反馈调节机制抑制促性腺激素释放激素的表达，影响机体性腺轴上其他相关基因的表达，从而发挥类雌激素样作用（王伟等，2014）。

2.6 增强免疫力 黄酮类化合物通过作用于机体免疫器官、调节垂体生长激素的分泌、刺激免疫细胞抗体的合成，调节体液免疫和非特异性免疫，改善机体的免疫机能，进而提高免疫力。在小鼠日粮中添加适量黄酮，可促进小鼠DNA和蛋白质合成，加速细胞的增殖，通过IFN-γ mRNA的高表达和IFN-γ的高分泌，激活NK细胞，刺激B细胞分泌抗体，增强机体免疫调节的能力 （唐浩国等，2007）。在LPS诱导下，苜蓿黄酮可能通过抑制 TLR2/MyD88/p38信号，降低 TNF-α、IL-1β 和IL-6等炎症因子基因的表达量，保护细胞免受炎性损伤（占今舜等，2018）。

3 苜蓿黄酮常用提取工艺

苜蓿中黄酮类化合物常用的提取工艺主要有有机溶剂浸提法、超声波辅助提取法、超声波辅助提取法。

3.1 有机溶剂浸提法 有机溶剂浸提法提取工艺简单、操作方便、条件容易控制、设备费用较低、提取剂容易消除、工业化可行性强，但提取效率低、试剂损耗大。尹卫等（2016）采用醇提法，以单因素试验及正交试验方法确定苜蓿黄酮类物质提取效果因素由大到小依次为料液比、乙醇浓度、提取温度，并优化最佳提取工艺为料液比1∶20、提取温度70℃、乙醇浓度70%，黄酮类物质提取量为0.0237 mg/mL。

3.2 超声波辅助提取法 超声波提取法是采用超声波的强烈振荡、空化效应和热效应的原理，使样品处于高温高压的环境，随着激波的产生，细胞受压破碎，释放胞内物质，致使目标物质溶解在溶剂的过程。超声辅助提取是从紫花苜蓿中获得黄酮的有效方法，与常规提取方法相比，使用超声辅助提取的提取物中总黄酮含量和抗氧化活性更高（Jing 等，2015）。刘香萍等（2016）通过响应面法优化超声波辅助提取苜蓿黄酮工艺得出，乙醇体积分数65%、提取温度67℃、超声波功率100 MHz、提取时间40 min时，黄酮的得率为5.29 mg/g。许英一等（2018）采用乙醇浸提、超声波辅助水提取和超声波辅助乙醇提取3种方法进行苜蓿黄酮的提取发现，总黄酮得率分别为（4.32±0.08）、（4.59±0.08）、（5.44±0.12）mg/g， 对超声波辅助乙醇提取黄酮的工艺进行优化后得出，苜蓿黄酮的得率达到6.43 mg/g。超声波辅助提取技术提取时间短、操作简便、适应性广泛、提取效率相对较高、提取物中纯度较大，但其提取工艺噪声污染严重。

3.3 微波辅助提取法 微波辅助提取通过强大的穿透能力到达样品的微管束和腺胞系统，在细胞内部产生高压高温破坏细胞屏障，释放细胞内容物。微波辅助提取具有适用范围广、目标选择性强、需求设备简便、萃取效率高、节省时间和萃取所需试剂污染较小、试验重复率高等特点。黄晓慧等（2017）通过单因素和正交试验设计，得到优化微波辅助提取苜蓿黄酮的工艺为提取时间30 min、乙醇浓度60%、微波功率600 W、固液比1∶15、提取温度80℃。张羽男等（2014）采用微波辅助提取法提取苜蓿黄酮，确定其最佳工艺为pH 10.0、固液比1∶50、功率140 W、提取时间30 s，提取率为14.587 mg/g。

4 苜蓿黄酮含量的差异

植物次级代谢物含量和生物活性如抗氧化活性、抗炎症等呈正相关（Barros等，2007），并可在一定范围内受植物生长环境的调节。其中，黄酮的含量因土壤类型、日照、降雨等因素在个体中差异较大（Pandey等，2009）。盐度是能够改变植物中多酚化合物含量的主要因素之一，高盐度的土壤可诱导植物抗氧化酶活化和抗氧化化合物的合成增加（Gupta等，2014）。研究表明，植物生长土壤的NaCl浓度增加后，黄酮类化合物含量有所增加（Colla等，2013）。也有研究表明，随着紫花苜蓿植株的生长总黄酮含量逐渐下降，结实期显著低于前面各个时期，并且以4年生紫花苜蓿中黄酮含量最高（高微微，2004）。采用不同光质和光照时间处理紫花苜蓿芽苗发现，白光最有利于紫花苜蓿黄酮类化合物的积累，且光照4～8 h时有利于黄酮类化合物的产生（冯娜娜，2016）。适当的干旱也有利于黄酮类化合物生物合成基因的表达，对于苜蓿黄酮类化合物的积累起到促进作用（Kang，2011）。

5 苜蓿黄酮在反刍动物方面的应用

5.1 在牛日粮中的应用 动物日粮中添加黄酮类化合物，其结构酚羟基氢原子可与过氧自由基相结合生成黄酮自由基，再与其他自由基发生反应终止自由基链式反应，提高动物机体清除自由基和抗氧化能力；同时黄酮类化合物可通过降低动物血液黏度和红细胞凝聚性，促进血液循环，提高糖、脂和蛋白质等营养物质代谢，从而促进营养物质的相互转化，促进体内蛋白质等营养物质合成，提高机体的非特异性免疫。

在奶牛基础日粮中添加60 mg/kg BW苜蓿黄酮发现，其可通过调节对蛋白质的吸收和代谢，改变牛奶的成分，调节瘤胃中的微生物群体以增加营养物质消化的趋势，提高谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性以改善抗氧化性，抑制淋巴细胞的凋亡以及调节血液中中性粒细胞和淋巴细胞的数量，从而改善奶牛的非特异性免疫（Zhan 等，2017）。

5.2 在绵羊日粮中的应用 在绵羊基础日粮中添加苜蓿黄酮提取物发现，其可通过提高谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、生长激素和胰岛素生长因子的量，调节绵羊的抗氧化性能和激素分泌，促进机体生长（王凯等，2017）。在萨福克小尾寒羊杂交羊基础日粮中添加苜蓿黄酮发现，其可调节绵羊脂类代谢，提高氮的利用效率，维持体内能量代谢及钙磷平衡，其血清中总抗氧化能力、超氧化物歧化酶、超氧阴离子清除能力和羟基自由基清除能力有升高趋势，具有促进动物生长的潜能。建议添加量为0.2%（刘艳丰等，2016；王梦竹等，2015）。

6 小结

尽管紫花苜蓿黄酮广泛用于传统医学治疗多种疾病，但到目前为止大多数研究都在体外进行，对体内的研究相对较少，且部分活性理论还未完全阐明，还没有足够的临床证据表明其效果。因此，需要标记物来标准化的分析活性化合物的功效。未来的研究应侧重于样品制备技术和分离工具的开发和应用，以便分析苜蓿提取物发挥功效的主要成分。因此，开发用于纯化单个生物活性化合物的先进方法将便于将来能够阐述其对动物有机体的作用机制。来自样品测定数据，动物模型研究以及使用标准化提取物或单个化合物的可靠临床试验对于证实其活性和确定有效剂量是必要的。