低水平激光照射对变应性鼻炎大鼠炎症反应及氧化应激的影响

周苏波，范洁

作者单位： 315000宁波，中国人民解放军第113医院（周苏波）；宁波市第九医院（范洁）

近年研究表明，变应性鼻炎（AR）是一种由Ⅰ型变态反应引起的鼻黏膜慢性非感染性疾病[1]。其中，肥大细胞、嗜酸性粒细胞和Th2淋巴细胞介导的炎症反应在该病的发生和发展中起到关键作用。因此，有学者提出氧化应激可能是AR的发病机制之一[2-5]。与此同时，大量的基础和临床研究表明，低水平激光（LLL）照射可以有效缓解AR的典型症状，降低鼻黏膜的充血水肿，并减少其复发，但具体的作用机制不明[6]。有研究表明，LLL是通过其非热的光化学效应[7]，发挥其减轻炎症反应，缓解疼痛，促进组织修复和再生的治疗功能[8]。其中，线粒体的吸收光谱和临床使用的 LLL波长接近[9]，因此线粒体可能是LLL发生光化学效应的主要受体。本实验利用 SD大鼠构建AR动物模型，对比LLL照射与否对大鼠AR典型症状，外周血中免疫球蛋白 E（IgE）、白介素-4（IL-4）和干扰素-（IFN-）的含量，鼻黏膜的病理反应及鼻黏膜线粒体呼吸控制率（RCR）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和三磷酸腺苷（ATP）含量的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 材料 5周龄SPF级SD大鼠（宁波大学实验动物中心，合格证号：0102017）60只，体质量180～220g，雌雄各半，标准饮食饲养。使用随机数字法随机等分为3组，即健康组（H组）、AR组（A组）、AR+LLL照射组（L组），每组20只。

1.2 实验仪器和试剂

1.2.1 实验仪器 半导体激光治疗仪（国械注准：20173244263，曼迪森MDC-1000-IP上海），超纯水制成机（CSR-4-10，爱斯泰克，北京），恒温水浴锅（东台电器厂，中国），离心机（东台电器厂，中国）。

1.2.2 实验试剂 卵清蛋白（OVA）（Ⅴ级，Sigma，美国），氢氧化铝（博奥生物，北京），磷酸缓冲盐溶液（PBS）缓冲液（Sigma，美国），SOD检测试剂盒（Bio-Vision，美国），MDA检测试剂盒（Bio-Vision，美国），ATP含量测试盒（Bio-Vision，美国），组织线粒体分离试剂盒（杰美基因医药，上海），RCR定量检测试剂盒（杰美基因医药，上海）。

1.3 AR建模及激光照射

1.3.1 基础致敏 A组和L组动物使用以OVA为致敏原，Al（OH）3为佐剂的1ml混悬液（0.3 mg OVA+30 mg Al（OH）3+0.9%氯化钠注射液）进行腹腔注射（每2天1次，共7次），以达到基础致敏的作用。H组则使用等量 0.9%氯化钠注射液腹腔注射2周。

1.3.2 鼻腔激发 A组和L组在基础致敏结束后隔 1d，使用 OVA（2%，50 l，1 次/d，7次）对大鼠双侧鼻孔进行滴鼻，以达到鼻腔激发的作用。激发后0～30min内，观察并记录大鼠典型的过敏症状（搔鼻、流涕、喷嚏）评分，其中1～2次的轻度搔鼻，记1分；剧烈搔鼻，记2分。1～3个喷嚏，记1分；4～10个喷嚏，记2分；11个以上的喷嚏，记3分。流涕至鼻孔，记1分；流涕超过前鼻孔，记2分；满脸流涕，记3分。当总分＞5分时，判断为建模成功。H组则给予等量0.9%氯化钠注射液滴鼻1周。

1.3.3 激发维持及激光照射 A组和L组大鼠建模成功后，继续使用OVA（2%，50 l，2次/周，2周）对大鼠双侧鼻孔进行滴鼻，以维持激发状态。H组则使用等量0.9%氯化钠注射液滴鼻2周。L组大鼠则在建模成功后，立即使用镓铝砷激光（650 nm，250 MV，1000 mJ，8 min/次，1次/d，2周）对每只大鼠双侧鼻孔进行照射。

1.4 观察指标 实验结束当天，观察每只大鼠半小时内（8∶00～8∶30 am）典型的过敏症状，按照AR典型过敏症状评分并记录。实验结束后，所有大鼠脱颈处死，立即经眼球各取血5ml，离心（3000r/min，15min）取上层血清，按照ELISA试剂盒说明书进行规范操作，获得吸光度值A，并根据标准曲线计算IgE、IL-4和IFN-的浓度。

1.5 鼻中隔黏膜HE染色 取各组大鼠单侧鼻中隔黏膜，甲醛固定脱水，常规石蜡包埋，切片，行苏木精-伊红染色（HE染色），观察各组黏膜的病理改变。

1.6 鼻黏膜RCR测定以及SOD、MDA和ATP含量的测定 所有大鼠，剪开双侧鼻腔，取剩余鼻黏膜组织200 mg。其中100mg按照组织线粒体分离试剂盒的使用说明书，在低温环境下快速提取新鲜线粒体。同时，使用清洗完毕的电极组装并连接电极室和控制盒，加入2 ml超纯水和磁力转子，20℃下预热15min。按照试剂盒使用说明书进行规范操作，并计算RCR。剩余100mg组织在离心管内制备成组织匀浆，放入沸水浴箱中10 min，取出摇匀、离心（3 500 r/min，10min），取上清液。按照各种检测试剂盒的使用说明，进行规范操作，并测得鼻黏膜组织内SOD、MDA和ATP的含量。

1.7 统计方法 采用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，多组采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组症状评分比较 3组搔鼻、喷嚏、流涕症状评分及总评分差异均有统计学意义（均P＜0.05），H组和L组总评分均低于A组（均P＜0.05）。见表1。

2.2 3组外周血IgE、IL-4和IFN-比较3组IFN-水平差异无统计学意义（P＞0.05），A组IgE和IL-4水平均显著高于H组和L组（均P＜0.05），而H组和L组差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

2.3 鼻中隔黏膜HE染色 H组可见典型正常的鼻中隔黏膜组织结构；A组可见大量炎性细胞浸润；经过激光照射后，L组中浸润的炎性细胞数量明显降低，上皮结构出现恢复。见封三彩图5。

周苏波，范洁.低水平激光照射对变应性鼻炎大鼠炎症反应及氧化应激的影响（见正文第1615页）

2.43组RCR、SOD、MDA和ATP水平比较 3组RCR、SOD、MDA和ATP差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表3。

3 讨论

近年来，对于AR发病机制的研究表明，AR可分为速发相[10]和迟发相[11]两个阶段，速发相主要是由于再次接触过敏源，由IgE介导激活肥大细胞、嗜酸性粒细胞，并释放炎症介质，快速引发典型的鼻部症状。而迟发相则是由速发相炎症介导，趋化、激活嗜酸粒细胞和Th2淋巴细胞，并分泌更多的炎症因子，导致炎症加剧，反复发作，最终导致组织重塑，进入慢性期。

董明等[4]研究发现，AR大鼠鼻黏膜上皮细胞线粒体数量增多，形态出现异常，并呈现进行性的损害。祁姗姗[12]的研究表明变应原激发6 h后，患者外周血单核细胞线粒体复合物Ⅰ发生功能障碍，且该功能障碍与外周嗜酸性粒细胞增多有关，并参与了AR的发病过程。Canterorecasens等[5]研究则表明，AR患者呼出气体中 NO含量明显高于正常人。这些研究均表明，氧化应激是AR重要的发病机制之一。

纵观整个发病过程，IgE介导的速发相反应可能是AR的起始病因；同时，炎症引发的氧化应激可能是进一步促进和加重炎症反应的原因。本研究结果显示AR大鼠外周血IgE和IL-4含量显著升高，IFN-含量却未见明显升高。提示再次接触过敏原的确引发IgE的升高，以介导速发相反应。同时，IL-4含量的升高，IFN-含量不变，则提示Th1和Th2免疫反应的失衡，Th2免疫反应占优。与此同时，鼻黏膜病理切片显示大量炎症细胞浸润。另一方面，鼻黏膜上皮细胞中MDA含量显著升高，SOD和ATP含量及RCR显著降低。提示细胞受到ROS损伤，同时内源性抗氧化能力降低，线粒体结构和功能的完整性及呼吸作用效率降低[13]，导致实际生成的ATP含量降低。这些均提示鼻黏膜上皮细胞发生氧化应激损伤，这些损伤也必然引发更加持续、剧烈的炎症反应。炎症反应和氧化应激损伤相互促进，进而形成恶性循环。与此同时，LLL照射的L组相较于A组，鼻黏膜上皮细胞中 MDA含量显著降低，而SOD和ATP含量以及RCR则显著升高。提示LLL促进了线粒体的氧化磷酸化功能，降低了ROS的生成和氧化应激损伤。同时L组外周血IgE和IL-4含量也显著降低，病理切片显示炎症反应减弱。提示 LLL可能是通过激活线粒体，抑制氧化应激反应，从而降低鼻黏膜的炎症反应，从而达到治疗AR的作用。

表33 组RCR、SOD、MDA和ATP水平比较