新疆阿魏内生菌Alternaria sp.TA26-16 化学成分的研究

蒋瑞娟， 宋 骏， 何 权， 徐建国， 朱 军， 斯建勇， 李晓瑾*

（1.新疆维吾尔自治区中药民族药研究所，国家中医药管理局新疆中药民族药资源重点实验室，新疆乌鲁木齐830002；2.新疆农业大学农学院，新疆 乌鲁木齐830052；3.中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所，中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室，北京100193）

植物内生真菌是指在生活史的某一阶段或全部阶段生活在健康植物组织内又不对植物组织造成明显病害症状的菌株。它不仅可以促进植物生长，提高植物有效成分含有量，优化生态环境，还可以产生一些与宿主植物相似或相同的生物活性成分，因此极具新药开发前景［1-2］。

新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen 是伞形科阿魏属植物［3］，全国仅在新疆伊犁地区有少量分布［4］，树脂为其药用部位，具有消积、化癥、散痞、杀虫等作用［5］。由于生长环境恶劣、花后结实即死等生理缺陷以及采胶方式错误、过度放牧等人为因素，新疆阿魏已被《中国珍稀濒危保护植物名录》 纳入三级重点保护濒危植物。利用现代技术手段，研究濒危药用植物内生真菌的化学成分对于缓解濒危植物压力、保护生态环境具有重大意义。

目前，课题组从新疆阿魏中分离得到内生菌337 株，经过筛选，内生菌株Alternaria.sp.TA26-16 具有较好的抗肿瘤活性。本研究对新疆阿魏内生菌株Alternaria sp.TA26-16 固体发酵产物的甲醇提取物进行化学成分研究，从中分离得到10个化合物，且所有化合物均为首次从该菌中分离得到。

1 材料

Bruker AV Ⅲ600 核磁共振波谱仪 （德国Bruker 公司）；EYEL4 旋转蒸发仪（广州爱浪仪器设备有限公司）；SA-1500-1 超净工作台（上海上净净化设备有限公司）；柱层层析硅胶（青岛海洋化工厂）；薄层色谱硅胶板GF254（烟台市化学工业研究所）。

内生真菌分离自新疆阿魏Ferula sinkiangensis K.M.Shen，由中国医学科学院药用植物研究所陈娟研究员鉴定为Alternaria sp.TA26-16，菌种保藏于新疆中药民族药研究所微生物实验室， 编号6626。

土豆培养基，土豆去皮，切成约2 cm3的小块，加1 000 mL 蒸馏水煮沸20 min，玻棒搅拌，双层纱布过滤，取滤液加20 g 葡萄糖、16 g 琼脂，补足滤液至1 000 mL，自然pH。

大米培养基，取60 g 大米放于锥形瓶中，倒入80 mL 蒸馏水，自然pH，高压灭菌20 min。

菌株发酵产物，菌株Alternaria sp.TA26-16 接种于土豆培养基25 ℃下培养5 d，再接种至大米培养基上25 ℃恒温发酵培养30 d。

2 提取与分离

用等量甲醇萃取菌株发酵产物3 次， 每次24 h，得甲醇提取物42 g，再用300 g 硅藻土拌样，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯洗脱，分别得相应部位10.6、9.4、8.7 g。

石油醚部位经硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（100 ∶1 ～1 ∶1），得14 个组分（Fr.2-1～14），Fr.2-3 经硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯（20 ∶1～1 ∶1） 梯度洗脱，得化合物1（6.4 mg）、2（7.9 mg）。取馏分Fr.2-7 凝胶柱分离，甲醇洗脱，得化合物3（5.3 mg）。取馏分Fr.2-14 硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯（20 ∶1） 洗脱，得化合物4（6.2 mg）。

二氯甲烷部位经硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱 （100 ∶0 ～0 ∶100）， 得17 个组分（Fr.3-1～17），Fr.3-3 经硅胶柱分离，石油醚-乙酸乙酯（60 ∶40） 洗脱，得化合物5（9.2 mg）、6（7.4 mg）。 Fr.3-15 经硅胶柱分离， 氯仿-甲醇（30 ∶1） 洗脱得化合物7（6.3 mg）。

乙酸乙酯部位经硅胶柱分离，氯仿-甲醇梯度洗脱（100 ∶0～0 ∶100），最后用甲醇洗脱。得19个组分（Fr.4-1 ～19），Fr.4-5 经硅胶柱分离，氯仿-甲醇（20 ∶1 ～0 ∶1） 梯度洗脱，得化合物8（6.1 mg）。 Fr.3-15 经硅胶柱分离， 氯仿-甲醇（30 ∶1） 洗脱，得化合物9（10.8 mg）。Fr.4-13利用半制备液相分离，甲醇-水（75 ∶25），得化合物10（6.5 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：淡黄色针晶（甲醇）。ESI-MS m／z：415［M ＋Na］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ：6.03（1H，d，J ＝9.4 Hz，H-6），5.73（1H，s，H-4），5.26（1H，dd，J ＝8.0，15.2 Hz，H-23），5.20（1H，dd，J ＝8.0，15.2 Hz，H-22），1.05（3H，d，J ＝6.6 Hz，H-21），0.99（3H，s，H-19），0.95（3H，s，H-18），0.93（3H，d，J ＝6.89 Hz，H-28），0.84（3H，d，J ＝7.1 Hz，H-27），0.82（3H，d，J ＝8.1 Hz，H-26）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3） δ：34.3（C-1），34.4（C-2），199.7（C-3），123.1（C-4），164.6（C-5），124.6（C-6），134.2（C-7），124.6（C-8），44.4（C-9），36.9（C-10），19.1（C-11），35.7（C-12），44.1（C-13），156.3（C-14），25.5（C-15），27.9（C-16），55.8（C-17），19.1（C-18），16.8（C-19），39.4（C-20），21.4（C-21），135.1（C-22），132.7（C-23），43.0（C-24），33.2（C-25），19.8（C-26），20.1（C-27），17.8（C-28）。以上数据与文献［6］ 基本一致，故鉴定为麦角甾-4，6，8（14），22E-四烯-3-酮。

化合 物2： 无 色 油 状 物。 ESI-MS m／z： 301［M＋Na］＋。1H-NMR（600 MHz，CDCl3） δ：7.96（2H，m，H-3，6），7.77（2H，m，H-4，5），4.56（4H，t，J ＝6.0 Hz，H-8，8′），1.96（4H，m，H-9，9′），1.68（4H，m，H-10，10′），1.21（6H，t，J ＝6.0 Hz，H-11，11′）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：134.4（C-1，2），130.9（C-3，8），133.0（C-4，5），170.4（C-7，7′），67.6（C-8，8′），32.8（C-9，9′），21.3（C-10，10′），15.8（C-11，11′）。以上数据与文献［7］ 基本一致，故鉴定为邻苯二甲酸二异丁酯。

化 合 物 3： 白 色 粉 末。 ESI-MS m／z： 282［M］＋。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.37（2H，m，H-9，10），2.37（2H，t，J ＝7.5 Hz，H-2），2.07（4H，m，H-8，11），1.65（2H，m，H-9，10），1.33～1.27（20H，m，H-4-7，12-17），0.91（3H，m，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：180.1（C-1），34.8（C-2），25.2（C-3），30.3-29.9（C-4-7），28.0（C-8，11），130.5（C-9），130.8（C-10），29.8 ～29.4（C-12-15），32.7（C-16），23.2（C-17），14.8（C-18）。以上数据与文献［8］ 基本一致，故鉴定为油酸。

化 合 物4： 白 色 固 体。1H-NMR （600 MHz，CDCl3）δ：7.93（2H，d，J ＝2.2 Hz，H-2，6），6.91（2H，d，J ＝2.0 Hz，H-3，5），2.58（3H，s，4-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：197.3（1-CHO），130.3（C-1），131.0（C-2，6），115.3（C-3，5），160.3（C-4），26.3（4-CH3）。以上数据与文献［9］ 基本一致，故鉴定为对甲基苯甲醛。

化合物5：白色晶体（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：0.63（3H，s，H-18），0.82（3H，s，H-27），0.83（3H，s，H-26），0.85（3H，s，H-29），0.91（3H，s，H-21），1.02（3H，s，H-19），3.53（1H，m，H-3），5.36（1H，brs，H-6）；13CNMR（150 MHz，CDCl3）δ：37.3（C-1），31.7（C-2），71.8（C-3），42.3（C-4），140.8（C-5），121.7（C-6），31.9（C-7），31.9（C-8），50.2（C-9），36.5（C-10），21.1（C-11），39.8（C-12），42.4（C-13），56.8（C-14），24.3（C-15），29.8（C-16），56.1（C-17），11.9（C-18），19.1（C-19），19.8（C-20），18.8（C-21），36.0（C-22），26.2（C-23），45.9（C-24），29.5（C-25），19.3（C-26），19.8（C-27），23.1（C-28），12.0（C-29）。以上数据和文献［10］ 基本一致，故鉴定为β-谷甾醇。

化合物6：淡黄色油状液。ESI-MS m／z：280［M］＋。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：5.34（4H，m，H-9，10，12，13），2.80（2H，m，H-11），2.33（2H，t，J ＝7.6 Hz，H-2），2.05（4H，m，H-8，14），1.63（2H，m，H-3），1.25 ～1.31（14H，m，H-4-7，H-13-16），0.97（3H，t，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：179.9（C-1），34.1（C-2），24.7（C-3），29.0 ～29.7（C-4-7），27.2（C-8），130.0（C-9），128.1（C-10），27.5（C-11），130.2（C-12），128.1（C-13），27.2（C-14），29.8（C-15），32.0（C-16），22.7（C-17），14.1（C-18）。以上数据与文献 ［11］ 基本一致，故鉴定为亚油酸。

化合物7： 白色固体。 ESI-MS m／z：121.06［M ＋H］＋。1H-NMR （600 MHz， CDCl3） δ：7.02（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-7，8），6.69（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-6，9）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δ：130.94（C-1），156.70（C-5），116.08（C-6，9），130.85（C-7，8）。以上数据与与文献［12］ 基本一致，故鉴定为2-oxabicyclo ［3，2，2］ nona-5，7，8-triene。

化合物8：淡黄色油状物。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.04（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-2，6），6.78（2H，d，J ＝8.4 Hz，H-3，5），2.84（2H，t，J ＝7.1 Hz，H-7），4.24（2H，t，J ＝7.1 Hz，H-8），2.03（3H，s，H-9）；13C-NMR （150 MHz，CDCl3） δ：129.3（C-1），130.0（C-2，C-6），115.4（C-3，C-5），154.7（C-4），34.1（C-7），65.6（C-8），21.1（C-9），172.1（C-10）。以上数据与文献［9］ 基本一致，故鉴定为2-（4-羟基苯基） 乙酸乙酯。

化合物9：黄色无定型粉末。1H-NMR（acetoned6，600 MHz）δ：7.28（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-6），6.71（1H，d，J ＝2.5 Hz，H-5′），6.61（1H，d，J ＝2.5 Hz，H-3′），6.37（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-4），2.77（3H，s）；13C-NMR（acetone-d6，150 MHz）δ：140.3（C-1），166.7（C-3），102.19（C-4），166.80（C-5），166.81（C-7），154.92（C-2′），160.08（C-4′）。以上数据与文献［13］ 基本一致，故鉴定为alternariol。

化合物10：浅紫色非晶粉末。 ESI-MS m／z：272［M］＋。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δ：11.79（1H，s，2-OH），10.79（1H，s，10-OH），7.18（1H，brs，H-5），6.71（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-11），6.63（1H，d，J ＝2.0 Hz，H-9），3.90（3H，s，H-4OCH3），2.72 （1H，s，8-CH3）；13C-NMR （150 MHz，DMSO-d6） δ：99.3（C-1），164.6（C-2），98.4（C-3），166.2（C-4），101.6（C-5），137.9（C-6），117.1（C-7），138.6（C-8），103.1（C-9），152.1（C-10），108.6 （C-11）， 158.1 （C-12），164.1（C-13）。以上数据与文献［14］ 基本一致，故鉴定为alternariol-4-methyl ether。

4 讨论

内生菌在植物中广泛分布，生物多样性丰富，参与植物生长过程中的重要环节［15］，并且参与植物次生代谢成分的转合，是天然产物的重要来源，其中大部分为新型生物活性物质，具有广阔的应用前景［16］。近年研究发现，内生菌除产生抗癌物质外，还可产生具有其他药用价值的活性物质，如抗生素、植物生长激素等［17］。现已有学者在药用植物内生菌中成功提取分离得到生物碱类、芳香族、萜类及挥发油类、黄酮类及其苷类、酚类和内酯类［18-19］。本研究从新疆阿魏内生真菌Alternaria sp.TA26-16 中分离得到10 个化合物，所有化合物均为首次分离得到，以期为今后药用植物内生真菌的研究提供实验基础和科学依据。