重组梅毒螺旋体诊断抗原的研究进展

王斯倩,符 波,赵宇龙,廖梦佳,李长清,曹龙古,曾铁兵

梅毒是由梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)感染引起的一种慢性多阶段发展的性传播疾病,严重危害成人与新生儿身心健康。目前尚无疫苗进行特异性预防,早诊断对防控梅毒意义重大。梅毒临床表现十分复杂,需依靠实验室检测以明确诊断,其中以血清学方法为主,尤其是检测特异性Tp抗体。最早以Tp全菌作为诊断抗原,但获取Tp抗原困难,且与其他密螺旋体有交叉抗原。近十余年来,基于重组诊断抗原的血清学方法大力促进了特异、快速、精准的梅毒血清学诊断的发展。但目前应用的重组抗原仍不能有效诊断早/晚期梅毒,或区分不同感染阶段,或疗效判断[1],需进一步寻找其他抗原。本文综述传统重组Tp膜脂蛋白及部分新型候选抗原在梅毒诊断中的应用价值及局限性,并进一步讨论最佳候选抗原的条件。

1 Tp分子生物学特征

1.1 基因组特征Tp无质粒,染色质基因组非常小。Tp全基因组同源性比对发现[2],Tp基因有约43%的开放性阅读框(ORF)未找到与之匹配的数据库,可能为功能不明的新基因[3]。Tp缺乏多种参与代谢的酶类[4],体外培养困难,不能进行基因操作,成为阻碍这些功能不明基因功能研究的主要瓶颈。

1.2 蛋白质组与免疫蛋白质组特征 先后应用SDS-PAGE、二维凝胶电泳(2DGE)[5]及互补质谱技术[6],发现Tp蛋白质组主要特征有:Tp外膜蛋白密度非常低(仅为大肠埃希菌外膜蛋白的1%),主要包括有种特异性、由12种蛋白组成的Tpr蛋白家族,以及一些暴露于膜表面的蛋白(最初以TROMPs命名,现主要根据ORF序列来命名,如Tp0326、Tp0453)。此外,位于周质间隙的鞭毛蛋白(传统上被命名为Fla)在Tp中表达量非常高[7]。Tp还存在大量脂蛋白,大多位于Tp的细胞内膜,脂蛋白基因表达水平也高[8]。

能够引起宿主免疫应答,并可与梅毒患者血清反应的蛋白统称为Tp免疫蛋白组。Brinkman[9]与McGill[5]应用免疫蛋白质组技术,分别从Tp重组蛋白表达文库和感染兔睾丸获取的Nichols株天然蛋白中,仅检测到了30余种免疫活性抗原。2个研究发现的免疫反应性蛋白虽不完全相同,但主要蛋白一致,主要包括一些通常可与不同期梅毒患者血清反应的内膜脂蛋白。该类脂蛋白未暴露于膜表面,但仍可引起高水平的抗体应答,所以均可用做梅毒的诊断抗原,极大地丰富了Tp特异性血清学检测。同时发现,Tp免疫蛋白质组中很少有位于膜表面的抗原,这限制了对Tp的检测。2个研究中免疫蛋白质组结果虽不同,但外膜蛋白在免疫诊断中的价值引起了学者们的兴趣。总之,免疫蛋白质组的数据表明了Tp免疫原性低,同时也列举了最具前景的梅毒诊断抗原。

2 重组Tp诊断抗原的基本功能与应用及局限性

2.1Tp膜脂蛋白诊断抗原 检测特异性Tp抗体最初以天然或经超声破碎的Tp细胞作为诊断抗原,目前仍用于荧光密螺旋体抗体吸收试验(FTAABS)、密螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)等试剂盒中。由于Tp无法在体外连续培养,获取其抗原困难,而且与其他密螺旋体有交叉抗原。近年来,重组蛋白技术极大地促进了Tp血清学诊断的发展。通过大肠埃希菌表达的重组蛋白作为诊断抗原,用于酶联免疫吸附试验(ELISA)或者蛋白印迹法(WB)等测定特异性Tp抗体。

最早用作重组诊断抗原的是Tp内膜脂蛋白Tp15(tp0171基因产物)、Tp17(tp0435基因产物)与Tp47(tp0574基因产物),三者均具强免疫原性。Tp15功能仍不明;Tp17为β-桶状蛋白[10],在维持膜结构、通过激活内皮细胞中表达黏附分子、趋化因子等方面起重要作用[11]。Tp47是一种羧肽酶(青霉素结合蛋白),能促进微血管内皮细胞合成细胞间黏附分子-1(ICAM-1)以及诱导血管间黏附分子[12]。早期的Tp诊断基于单一的重组抗原,Tp15、Tp17和Tp47检测的敏感性和特异性分别是100%、96%、100%和100%、100%、20%[13],而2种以上抗原组合可提高检测敏感性,继而建立了人工嵌合体脂蛋白Tp15-Tp17-Tp47,同时结合ELISA[14]和微型蛋白质芯片技术[15],作为快速简便的梅毒血清学诊断方法。此外,重组脂蛋白还包括目前被用做诊断抗原的Tmp A(tp0768基因产物)[16]和 Tpp15-Tpp17-Tp44.5-Tp47融合抗原(Meridian Life Science,Inc.,Memphis,Tennessee USA)。少数应用TmpC(tp0319基因产物,嘌呤核苷受体脂蛋白)[17]与MglB-2(tp0684基因产物,甲基半乳糖苷ABC转运蛋白)做诊断抗原[18]。脂蛋白的抗原组合用于免疫印迹(WB)中,显示出高度敏感性和特异性[19]。

最新发现的Tp32脂蛋白 (tp0821基因产物)是一种结合L-甲硫氨酸的Tp内膜脂蛋白[20]。该蛋白在Brinkman[9]和McGill[5]的研究中无明显免疫反应性,但Xie等[20]结果显示出IgM和IgG的阳性率分别高达91.0%和98.3%,与其他方式的检测结果一致。以重组Tp0821与莱姆病、钩端螺旋体病患者以及健康人群血清交叉反应的特异性为94.3%～100%,提示Tp0821经进一步验证后可作为一类新型的梅毒诊断抗原[20]。

总之,基于重组脂蛋白技术的Tp特异性抗体检测能使梅毒诊断的特异性和敏感性达95%～99%,但对早、晚期梅毒诊断[21]以及疗效判定不太有效,也不能区分梅毒所处的感染阶段,而免疫蛋白质组研究结果表明,在感染期间可能针对某些Tp抗原产生不同免疫应答。因此,必须扩大范围寻找用于梅毒各个感染时期的诊断抗原。

2.2Tp表面暴露蛋白诊断抗原 外膜蛋白是最重要的免疫靶标,但Tp外膜蛋白含量非常少,在Cox的研究中[22]仅确定了17个候选外膜蛋白,包括7个Tpr家族成员、9个非Tpr假定蛋白以及Tp0326(Tp92)蛋白。

Tpr家族蛋白包含了12个蛋白,分为3个亚族。亚族Ⅰ(TprC、Tpr D、TprI、Tpr F)在C端、N端以及中央区域有保守序列,预测大多位于外膜,与膜的渗透性有关。亚族Ⅱ(Tpr E、Tpr G、TprJ)有共同的N端和C端,中间为序列与长度不等的中央区域。亚族Ⅲ(Tpr A、TprB、Tpr H、Tpr K、Tpr L)同源性较低,有不同的可变区,其中Tpr K(tp0897基因产物)有7个可变区,该区是抗体重要的应答靶位,但由于高度异变使Tp逃脱免疫清除[23]。出人意料的是,尽管针对亚族Ⅰ的Tpr蛋白及Tpr K的N端保守区能产生很强的抗体和T细胞应答,但在Brinkman[9]和McGill[5]的免疫蛋白质组研究中均未显示出免疫反应性,这可能与上述Tpr蛋白的变异性有关,尤其是Tpr K。基于在Tp致病及免疫逃逸中的重要作用,Tpr蛋白家族可用作Tp候选疫苗抗原,但作为诊断抗原具有一定限制性[1]。

非Tpr家族的表面暴露的密螺旋体稀有外膜蛋白称为TROMPs,包含 TROMP-1(31-k Da)、TROMP-2(28-k Da)及TROMP-3(65-k Da)。在先前的研究中TROMPs和感染兔及梅毒血清反应[24],而Brinkman[9]研究中TROMP-2(Fla A同系物,tp0663基因产物)仅和一期梅毒血清反应。在McGill[5]的Tp蛋白组研究中首次确定了TROMPs蛋白,但WB试验未显示出其与梅毒血清反应。目前,Tp0663被确定为新的血清诊断候选抗原,其对于检测不同阶段的梅毒感染具有高度敏感性(98.83%)和特异性 (100%)[25]。

Tp0326(Tp92)也称为Bam A,为膜表面蛋白,与革兰氏阴性家族高保守的β-桶状复合物序列同源[26],其N端有多肽转运相关结构域(POTRA),C端有β桶状结构[26]。Brinkman研究中Tp0326显示免疫反应性[9],但McGill研究中[5]却不与潜伏期梅毒血清反应,也无免疫原性,这是因为Tp0326在Tp蛋白组中表达量非常少,针对POTRA与β-桶状结构部分2个表位产生的抗体很少。出人意料的是,Tp感染兔血清均可与这2个表位反应,而人类二期梅毒血清仅对POTRA反应[25]。最近,Luthra[27]研究结果表明Tp0326的β桶状结构域只有在完整的Tp中才有表面暴露的抗原表位。根据这些结果,基于重组Tp0326、Tp0326与Tp0453组合、Tp0326-0453融合蛋白的梅毒诊断试剂盒已经被开发[28]。

Tp0453蛋白为穿孔蛋白(假想的脂蛋白),位于Tp外膜的内表面,参与脂质与糖脂运载。Brinkman研究中Tp0453无血清反应性[9],但McGill研究中显示出能与一期梅毒血清反应[5],这个结果与Van Voorhis数据一致[29]:当其与梅毒血清反应时显示出100%特异性与100%敏感性,而不与回归热、莱姆病或钩端螺旋体病患者血清发生交叉反应。最近,通过p ET28a载体表达得到可溶性Tp0453,基于Tp0453的ELISA诊断试剂盒亦可获得。基于重组Tp0453及Tp0453-Tp0326融合蛋白的ELISA方法也有报道,两者的敏感性和特异性分别为98%和98%、100%和99%,这些蛋白均为可用于梅毒血清学诊断的新型候选抗原[28]。目前包含Tp0453与传统的Tp15、Tp17、Tp47、Tmp A和新型Gpd(Tp0257)抗原的WB试剂盒Recom Blot Treponema IgG/IgM 2.0(Mikrogen Gmb H,Germany)已实现商品化。

2.3Tp黏附素、周质蛋白、鞭毛蛋白诊断抗原Tp0155和Tp0483蛋白是Tp的假定黏附素,能结合纤粘蛋白,但两者在免疫蛋白组研究中[5,9]并未表现出血清反应性。在与一期梅毒早期感染血清反应时,均仅有9%的患者血清显示出阳性结果[29]。

Tp0136是暴露于Tp膜外的假定黏附素/脂蛋白,能结合纤粘蛋白和层粘连蛋白。相比细胞纤维蛋白,Tp0136更能有效通过其N端保守区域与血浆纤维蛋白结合[30]。当宿主对Tp应答时,Tp0136转录水平很高,可能对Tp持久存活起重要作用。Tp0136在McGill蛋白组研究中无免疫反应性[5],而在Brinkman研究中主要对一期梅毒血清有反应[9]。杨珺等[31]表达分子量为28kDa的可溶性Tp0136活性肽段(Tp0136B),与早期梅毒血清反应的阳性率为85.5%,在一期梅毒诊断中有良好的前景。

Tp0751是Tp重要黏附素,能结合层连蛋白,也是Tp金属蛋白酶。与其共转录的Tp0750是一种丝氨酸蛋白酶,能降解凝块组分(纤维蛋白原和纤连蛋白)[32],被预测和Tp0751一起发挥作用,与Tp入侵宿主和体内播散有关。尽管Tp0751与Tp致病性有关,但其在上述的2个免疫组蛋白实验中并未显示出反应性,在Brinkman研究中[9],对早期潜伏期梅毒血清仅表现出轻微反应性。在一项比较性研究中,相比Tp0257(Gpd)以及Tp1038(Tp F1),Tp0751表现出了更低的血清反应性[28]。虽然在诊断方面有局限性,但它显示出了很好的免疫保护性,有希望成为一种梅毒候选疫苗分子[33]。

Tp0257(Gpd)与许多病原体的甘油磷酸二酯酶蛋白家族同源,可水解脱酰化磷脂,起初被认为暴露于外膜表面,但进一步研究表明为周质间隙多肽。在Brinkman[9]研究中,Tp0257能与一期、二期及早期潜伏期梅毒血清反应,但McGill研究中未检测到该蛋白[5]。目前仅有少量关于重组Tp0257和Tp0453一起用于梅毒血清检测的数据报道[29]。

Tp1038(Tp F1,4D抗原)与铁元素的吸收有关系,属细菌铁蛋白[34]。在Brinkman[9]研究中,Tp1038能与潜伏期梅毒血清反应,在McGill[5]研究中,其寡聚体能与所有期的梅毒血清反应,而单体则不能。Jiang等[34]研究表明,重组Tp1038对所有期的梅毒血清都表现出很高的灵敏性(93.3%～100%),交叉反应显示出极高的特异性(100%),被认为是一种非常有前景的梅毒诊断候选抗原。

Tp0965为膜融合蛋白,位于Tp周质,能激活内皮细胞,增加单层内皮细胞的通透性[36]。Tp0965在McGill研究中能与各期梅毒血清反应,有潜在的诊断价值。Long等[37]发现重组Tp0965能与临床各期梅毒血清反应,表现出良好的敏感性与特异性。Runina[38]发现重组Tp0965检测各期梅毒总的敏感性与特异性分别为98.8%和87.5%,对一期与早期潜伏梅毒的敏感性非常高(达100%)。这些结果提示Tp0965也是一种非常有前景的新型梅毒诊断候选抗原。

鞭毛蛋白是Tp的重要抗原,由轴丝核心蛋白Tp0868(FlaB1)、Tp0792(FlaB2)和 Tp0870(FlaB3)、鞘蛋白Tp0249(Fla A1)、钩状基复合蛋白(Tp0398和Tp0727)及马达蛋白 (Tp0400)构成。Tp0398和Tp0727在Brinkman[9]研究中有血清反应性,Mc Gill[5]结果也表明大部分鞭毛蛋白能与所有期的梅毒血清反应。早期研究发现鞭毛蛋白与螺旋体属的很多蛋白有交叉反应,这限制了其在梅毒诊断中的应用。Jiang等[39]以重组FlaB1、FlaB2与FlaB3检测相应IgG有很高的敏感性和特异性,分别达 95.4%、98.9%、92.6% 和 95.8%、95.1%、95.8%,检测一期梅毒和先天性梅毒相应的IgM敏感性和特异性分别为76.8%和83.1%、72.0%和87.7%、74.4%和89.2%,表明三者也可作为梅毒血清学诊断的候选抗原。为提高特异性,最近Tan等[40]构建Tp的FlaB1、FlaB2和Fla B3保守的N端、C端及中间可变区M肽段,ELISA检测临床标本特异性IgG,发现FlaB3的M肽段(B3M)的敏感性和特异性最高,分别为95%和100%,是有希望的候选抗原。

总之,新型重组抗原在梅毒血清学诊断中具有潜在价值,但也存在局限性。例如,某些蛋白 (如Tp0136、Tp0257和Tp1038)对一期和早期梅毒检测更有价值;相对传统的Tp免疫优势脂蛋白,有些蛋白的敏感性(如Tp0155、Tp0483、Tp0751)和特异性(如Tp0868、Tp0792、Tp0870)较低[1]。

3 Tp诊断抗原未来的发展方向

目前的研究表明,很多有望成为提高梅毒血清学诊断效果的新型候选抗原的实际检测效果远不如传统重组脂蛋白,开发新的Tp重组抗原尤为必要。可考虑应用以下策略:针对Tp感染过程中可改变自身生物学行为、在不同感染时期形成不同的蛋白表达谱的特点,应用免疫蛋白质组学(如非标定量Label-free质谱技术结合免疫印迹)等方法技术,以不同感染阶段的梅毒患者或感染兔血清筛选某一特定梅毒阶段(如早期或晚期或治愈后梅毒)表达的抗原,以其作为该阶段的生物标记物检测相应抗体。筛选理想诊断抗原应符合以下条件[1]:①可检测的免疫反应性;②在不同梅毒感染阶段的表达水平;③感染消除后免疫应答水平下降。通过定量与定性分析其相应抗体水平,可早期诊断和区分不同感染阶段的梅毒,判断梅毒治疗效果,同时联合应用重组抗原(多价融合蛋白或多价表位多肽)以提高检测的敏感性和特异性[41]。最近,Liu等[42]应用生物信息学分析和兔感染模型鉴定出Tp0971、Tp0768、Tp0462为感染依赖性抗原(Tp在早期感染机体阶段合成分泌到菌体胞内外的蛋白抗原),分别基于此3种抗原的ELISA方法均与商品化TPPA和Tp-ELISA试剂盒有很好的一致性,而分析随访梅毒患者Tp0971抗体与RPR滴度变化的相关性表明,Tp0971有希望用于梅毒疗效的检测。

梅毒血清学诊断的发展速度已经放缓,但发展Tp重组抗原仍然是多学科生物医学研究领域面临的实际任务,需要开展大量的实验室工作和临床工作。

利益冲突:无

引用本文格式:王斯倩,符波,赵宇龙,等.重组梅毒螺旋体诊断抗原的研究进展[J].中国人兽共患病学报,2019,35(9):837-842.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.116