肝细胞癌的RNA甲基化修饰*

金 春， 李蒙蒙， 李余佳， 高俪原， 梁宝瑜， 王桭屹， 张 峰, 2, 3， 邵江娟, 2, 3△， 郑仕中, 2, 3△

[南京中医药大学 1江苏省中药药效与安全性评价重点实验室， 2江苏省中药功效物质重点实验室， 3中药品质与效能国家重点实验室(培育)， 江苏 南京 210023]

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常见的肝脏原发性肿瘤，其具有起病隐匿、发病率高、生长迅速、侵袭性强和致死率高等特点，目前尚缺乏有效的治疗手段，因此更好地阐明肝癌发生的分子机制对于开发新的诊断方法以及鉴定新的治疗靶点至关重要。近年来随着高通量测序技术的快速发展，表观遗传修饰尤其是甲基化修饰研究开始得到了重视，人类肿瘤中常见的表观遗传甲基化修饰包括DNA甲基化、组蛋白甲基化及近年来兴起的RNA甲基化。本文就近年来RNA甲基化修饰在HCC领域的相关研究做一综述，为HCC发病机制的研究提供新的方向。

1 DNA和组蛋白甲基化修饰与HCC

在胞嘧啶残基的第5位共价连接甲基称为DNA的甲基化，这对于调控基因的表达和个体正常发育是非常重要的。DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMT)家族的DNMT3A/3B负责该过程[1]。最近，一组称为10-11转位酶1～3(ten-eleven translocation 1～3, Tet1～3)的蛋白质被鉴定，它们可识别5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, m5C)并通过中间体5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine, 5hmC)将其去甲基化为胞嘧啶[2]。三十多年来，DNA甲基化一直是肿瘤研究的焦点，DNA甲基转移酶抑制剂氮杂胞苷和地西他滨已被批准用于治疗肿瘤。已知在HCC组织存在全基因组低DNA甲基化和高DNA甲基化区域，DNA甲基化介导的肿瘤抑制基因启动子失活是HCC发展的重要机制[3-4]。但HCC中异常表达的长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA) DNA甲基化的研究仍处于初始阶段，如lncRNA ZEB1-AS1在HCC中过表达，DNA甲基化分析显示其启动子处于低甲基化状态并与HCC患者预后不良相关[5]。而在HCC中新鉴定的异常表达的lncRNA MITA1 CpG岛DNA甲基化也被证实参与调控MITA1的表达，继而影响下游的上皮-间充质转化相关转录因子Slug，促进了HCC的转移[6]。因此，相比单一研究DNA甲基化，将该修饰和非编码RNA之间的相互作用与HCC联系起来，可能是改善单一甲基化酶抑制剂不良反应的突破口。

除此之外，组蛋白可通过乙酰化、甲基化和磷酸化等途径调控目的基因的表达，进而影响HCC的进展。在组蛋白的各种修饰酶中，组蛋白甲基转移酶和去甲基化酶是抗肿瘤药物开发分子靶点研究的主要焦点。不同位点组蛋白甲基化由不同的酶负责，已鉴定组蛋白甲基转移酶DOT1、EZH2、SUV39H1和SETDB1在人类HCC中失调[7]。Fei等[8]研究表明组蛋白H3K9甲基转移酶SETDB1在HCC中基因拷贝数增加、过度表达并抑制HCC生长，同时肿瘤细胞依赖于SETDB1是基于p53突变状态。该研究提出了SETDB1通过p53甲基化调节肝癌细胞生长的新机制。而组蛋白甲基转移酶G9a(也称常染色质组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶2，EHMT2)由于基因拷贝数的增加或转录后调节因子miRNA-1下调而在人HCC中经常上调，失调的G9a通过表观遗传沉默肿瘤抑制因子维甲酸受体应答器3(retinoic acid receptor responder 3，RARRES3)发挥促肿瘤增殖的效应[9]。鉴于G9a在调节组蛋白修饰中的重要性以及它在人类HCC中高度上调的事实，且G9a至少部分地通过肿瘤抑制因子RARRES3的表观遗传沉默发挥肿瘤促进功能。尽管这些发现表明G9a是HCC的潜在治疗靶点，但G9a在HCC中的生物学功能仍有待阐明。

2 RNA甲基化概述

与DNA修饰相比，RNA修饰更加多样化和复杂化。DNA和组蛋白的甲基化修饰主要在转录水平上起作用，而可逆的RNA甲基化主要在转录后水平上调控基因表达。目前已鉴定的各种RNA修饰超过一百多种，其中RNA甲基化是最常见的修饰方式之一。修饰方式主要包括N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine,m6A)修饰、m5C修饰、N1-甲基腺苷(N1-me-thyladenosine,m1A)修饰等。近年来，高通量测序技术给我们提供了转录组范围内的mRNA修饰位点的图谱，大大推进了RNA甲基化的研究进展。下文将根据不同的修饰方式对RNA甲基化进行总结。

2.1m6A修饰 m6A修饰是在多种甲基化酶以及去甲基化酶协同作用下的可逆过程，m6A甲基转移酶复合物利用S-腺苷基甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)提供的甲基取代腺嘌呤第6位氮原子所连接的氢，其在mRNA代谢的各个方面起着重要的调节作用，包括mRNA的转录、衰变、变性和翻译[10]。甲基转移酶与去甲基化酶是维持m6A修饰过程的主要关键酶，其中甲基转移酶样3(methyltransferase-like 3，METTL3)、甲基转移酶样14(me-thyltransferase-like 14，METTL14)和Wilms肿瘤1相关蛋白(Wilms tumour 1-associated protein，WTAP)形成甲基转移酶复合物,用于催化m6A修饰的完成。随着研究的深入，Ma等[11]报道了一种新的m6A甲基转移酶——含锌指CCHC型蛋白4(zinc finger CCHC-type containing 4，ZCCHC4)，其具有潜在的N6-甲基腺苷甲基转移酶样结构域——保守的催化基序DPPF和CCHC-ZnF结构域，主要催化人28S rRNA发生甲基化并在HCC中高表达，与HCC的发生发展密切相关。而去甲基化酶——脂肪量和肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein，FTO)和AlkB同源物5(AlkB homolog 5，ALKBH5)可以去除m6A修饰[12]，维持m6A修饰动态平衡。值得注意的是，RNA发生m6A修饰后需与特定的m6A读取器——YTH结构域结合蛋白相互作用才能发挥相应的生物学功能。新鉴定的m6A读取器分子包括胰岛素样生长因子结合蛋白1(insulin-like growth factor binding protein 1，IGFBP1)，这些阅读器分子可以促进mRNA稳定性和翻译过程[13]。逐渐完善的m6A修饰研究充分揭示了m6A修饰在肿瘤中的重要作用。Cui等[14]报道了m6A参与胶质母细胞瘤干细胞(glioblastoma stem cells，GSC)自我更新和分化的调节过程; Ma等[15]研究发现敲减METTL14的表达可增强HCC的转移能力，而METTL14的过表达在体外和体内均抑制HCC的转移。因此，随着越来越多的m6A修饰的甲基转移酶和去甲基化酶被鉴定，m6A修饰在肿瘤中的生物学作用也将随之被揭示。

2.2m5C修饰 m5C是指胞嘧啶的第5位碳原子发生了甲基化，其修饰水平远远低于m6A。m5C修饰在转录组中具有保守、组织特异性和动态特征，集中于CG富集区域和邻近的翻译起始位点下游的区域[16]。该修饰主要发生在tRNA和rRNA且通常与蛋白质的翻译过程有关，而这些过程都与疾病过程密切相关。催化tRNA中m5C修饰的RNA甲基化酶主要是NOP2/Sun RNA甲基转移酶家族成员2(NOP2/Sun RNA methyltransferase family member 2，NSUN2)以及tRNA天冬氨酸甲基转移酶1(tRNA aspartic acid methyltransferase 1，TRDMT1)[17]。

2.3m1A修饰 m1A修饰即RNA腺苷上的N1-甲基化，它发生在Watson-Crick界面可能会影响RNA碱基配对过程，该修饰增加tRNA结构稳定性并诱导正确的tRNA折叠[18]。m1A RNA在生理条件下带有正电荷，影响了被修饰的RNA和相关蛋白质的相互作用。在细胞核中，通过tRNA m1A甲基转移酶复合物TRMT6/ 61A可对特异性pre-mRNA进行 m1A修饰，并分别被AlkB同源蛋白ALKBH1和ALKBH3清除。由于m1A是在mRNA和tRNA中新发现的修饰，其功能尚未被广泛研究[19]。

2.4其它RNA修饰 尽管已鉴定的RNA常见修饰是m6A、m5C和m1A，但远不止这些。最近，He等[20]鉴定了一种新的mRNA修饰——胞苷乙酰化(cytidine acetylation，ac4C)，ac4C修饰能够增加转录本的稳定性和翻译效率。该修饰过程由N-乙酰转移酶10(N-acetyltransferase 10，NAT10)催化产生。已知NAT10是一种核仁乙酰转移酶，在HCC细胞的细胞核、细胞质和细胞膜中均表达。与核表达的NAT10相比，胞质中的NAT10与HCC患者的预后不良密切相关[21]。随着各种技术的成熟，越来越多新的mRNA修饰方式会被发现，探究这些新修饰方式的调节过程并与HCC病理生理过程相联系，将完善RNA甲基化修饰在肝细胞癌发病机制中的潜在作用。

3 RNA甲基化的m6A修饰与HCC

大量的研究表明异常的m6A修饰可能促进肿瘤以及其它疾病的发生，其中m6A修饰相关关键酶是影响肿瘤发生发展的主要因素。已知m6A修饰高度富集在mRNA的3′-非翻译区(3′-untranslated region, 3′-UTR)，而mRNA是微小RNA(microRNA，miRNA)的靶结合区域[22]。已知HCC中存在许多异常表达的miRNA，如高表达的miR-15a-5p 影响了HCC细胞增殖和迁移能力[23]，miR-483-5p 高表达可通过部份上调人胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)基因P3 mRNA 转录促进HCC细胞的生长、迁移与侵袭，进而参与HCC的发生过程[24]，且miRNA可通过调节Wnt或STAT3信号通路影响HCC的发生及恶性转移[25]。因此，m6A修饰可能通过调节miRNA与mRNA的结合过程从而影响HCC。先前，有研究发现m6A修饰可以通过METTL3/m6A的方式识别微处理器蛋白DGCR8来调控RNA加工过程，表明METTL3/m6A的变化可能会导致许多生物过程包括肿瘤中miRNA的异常表达。而Ma等[15]发现m6A修饰在HCC中尤其是转移性的HCC中显著下调，METTL14是m6A修饰异常的主要因素。最终在Alarcon的研究基础上确定了METTL14与微处理器蛋白DGCR8相互作用，以m6A依赖性方式调控miRNA-126的加工过程，从而抑制HCC的转移。这些研究结果揭示了甲基转移酶通过调控HCC相关的miRNA影响HCC的转移。Chen等[26]通过转录组测序发现METTL3在人HCC和多种实体瘤中的表达显著上调，体内外实验均发现过表达METTL3能够促进HCC的生长，而细胞因子信号抑制因子2(suppressor of cytokine signaling 2，SOCS2)是METTL3介导m6A修饰的主要靶标，即METTL3通过含YTH结构域家族蛋白2(YTH domain-containing family protein 2, YTHDF2)转录后沉默SOCS2，从而促进HCC的发展。这项研究从过表达的甲基转移酶与阅读器分子相互作用的角度论证了METTL3的促肿瘤生长作用，将HCC中异常表达的METTL3作为抑癌药物研发的靶点可能是RNA甲基化修饰在新药开发领域应用的最直观方式。

去甲基化酶FTO可有效调节核mRNA加工过程，如选择性剪接和(或)对mRNA的3′端进行加工。有报道FTO通过下调转录物mRNA中的m6A水平，增加过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α)的表达恢复线粒体活性，诱导氧化应激和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)产生，从而促进肿瘤细胞生长[27]。 Zhang等[28]发现ALKBH5在GSC中高表达，m6A-Seq分析表明ALKBH5通过转录因子FOXM1去甲基化导致FOXM1表达上调，从而维持胶质母细胞瘤细胞的干细胞样特性。但ALKBH5的功能并非是GSC中所特有的，已有文献报道ALKBH5可介导HIF-1α依赖性乳腺癌的肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSC)表型，证明ALKBH5对维持肿瘤细胞干性特征具有重要作用。而ALKBH5对HCC是否具有重要作用尚未有相关文献涉及，探讨ALKBH5在肝癌干细胞中的相关作用可能有助于完善m6A修饰在肿瘤领域的意义。

m6A结合蛋白可以识别mRNA的m6A修饰位点从而介导mRNA降解，但其作用机制尚不清楚[29]。已鉴定的第1个m6A结合蛋白是YTHDF2，主要功能是调节mRNA的稳定性。研究表明过表达YTHDF2抑制HCC细胞增殖、生长及细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinases，ERK)和丝裂原活化蛋白激酶-ERK激酶(mitogen-actinated protein kinase-ERK kinases, MEK)的活化；进一步的机制研究发现YTHDF2直接结合表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)3′-UTR的m6A修饰位点以促进HCC细胞中EGFR的mRNA降解。该研究提示YTHDF2可能通过破坏HCC中EGFR mRNA的稳定作用来抑制细胞增殖和生长，是肿瘤抑制因子[30]。Yang等[31]研究了YTHDF2的转录后调控过程，发现靶向YTHDF2 mRNA的3′-UTR极有可能是miR-145，而miR-145的表达水平与临床HCC组织中YTHDF2的表达水平呈负相关，miR-145靶向YTHDF2可抑制HCC细胞的增殖，即YTHDF2通过下调m6A水平参与HCC发展。总的来说，YTHDF2在HCC中的多种功能可能取决于其靶mRNA的降解。

YTH家族的YTHDF1与YTHDF2共享YTH结构域，都可以结合mRNA中的m6A位点[32]。同样，高表达的YTHDF1与HCC的预后不良有关，进行YTHDF1共表达基因的GO和KEGG通路分析发现YTHDF1在调节HCC细胞周期进展和代谢中起重要作用[33]。由于大多数研究集中于HCC内在的致癌途径，m6A修饰在宿主抗肿瘤免疫应答中的潜在作用却很少有研究者关注。Han等[34]研究发现YTHDF1缺陷小鼠抗原特异性CD8+T细胞抗肿瘤反应升高，经典树突细胞中YTHDF1的缺失增强了肿瘤抗原的交叉呈递。YTHDF1与编码溶酶体蛋白酶的转录物的识别与结合增加了树突细胞中溶酶体组织蛋白酶的翻译，并且抑制组织蛋白酶所增强的野生型树突细胞的交叉呈递，提示YTHDF1可能是抗HCC免疫疗法的潜在治疗靶点。

综上所述，参与m6A修饰过程的多个修饰酶或分子都有可能在HCC中异常表达，与下游分子或miRNA相互作用调控HCC的进程，但这些修饰酶在抗肿瘤免疫疗法中的作用同样不容忽视。

4 RNA甲基化的m5C修饰与HCC

m5C、m1A及ac4C是新的RNA修饰方式，但尚未有研究完全阐明不同类型RNA修饰特有的生物功能以及这些修饰间的相互作用。Li等[17]研究发现NSUN2催化的m5C修饰与METTL3/METTL14催化的m6A修饰能够协同上调p21的表达，即METTL3/METTL14催化的m6A可以促进NSUN2对m5C的甲基化，同样NSUN2对m5C的甲基化也促进了m6A修饰，这2个甲基化修饰之间的相互作用促进了氧化应激诱导的衰老细胞中p21的表达，而p21是一种重要的抑癌基因，与HCC或其他各类肿瘤的恶性转化密切相关。各类的甲基化转移酶可以催化多种编码或非编码的RNA发生甲基化，据此推测NSUN2、METTL3/METTL14的相互作用一定不限于调控p21的表达从而影响到肿瘤的发展。当前的多数研究只限于一种甲基化模式发生后的效应或定位于某一个特定的参与甲基化过程的酶，而这种研究2种或多种甲基化修饰之间协同调控发挥相应作用的思路是较为新颖的。

5 RNA甲基化的m1A修饰与HCC

据报道m1A去甲基化酶ALKBH3在HCC中过表达并且与HCC的分化程度以及TNM分期密切相关。ALKBH3敲减可能通过p21/p27介导使细胞周期停滞在G1期，从而抑制HCC细胞增殖[35]。该项研究结果揭示了m1A去甲基化酶ALKBH3在HCC中的重要作用，可作为诊断治疗HCC的新型靶点。而另一去甲基化酶ALKBH1在HCC领域则鲜有报道，但已有研究指出ALKBH1作为RNA去甲基化酶介导从tRNA中的m1A中去除甲基，通过调节tRNAiMet的细胞水平和其他ALKBH1靶tRNA与多核糖体的结合来调节翻译起始和延伸，从而影响蛋白质合成[36]。这一发现揭示了通过可逆tRNA甲基化控制翻译的新途径和机制，若将该转录后调节机制应用于HCC领域，并与DNA、组蛋白甲基化的调控转录机制互相补充，可能是在整体转录水平阐明HCC进程的方式之一。

6 RNA的 ac4C修饰与HCC

已鉴定胞质中的NAT10参与催化RNA的ac4C修饰，且NAT10与HCC患者的预后不良密切相关，通过用定位在细胞质和膜中的NAT10缺失突变体找到NAT10的两个潜在核定位信号是残基68-75和989-1018，细胞质和膜性NAT10突变体(Flag-NAT10-D3)与细胞质中的α-微管蛋白和细胞膜上的整合素共定位且NAT10-D3促进α-微管蛋白乙酰化并稳定微管的结构[37],因而Flag-NAT10-D3可以促进HCC细胞的迁移和侵袭,这是NAT10影响HCC转移及预后不良的有力证据。先前研究表明NAT10将肿瘤抑制因子p53乙酰化并调节p53活化，而HCC中的p53基因经常发生突变并与HCC的发生和发展相关。 Li等[21]在此基础上探究了NAT10在HCC中的作用，发现NAT10在HCC组织中经常上调，与HCC患者的短存活率相关，这主要是由于NAT10与HCC中的鼠双微体2同系物(murine double minute 2 homolog，MDM2)相互作用上调突变的p53水平，从而促进带有突变的HCC细胞过度增殖。阻断NAT10和p53之间相互作用有利于治疗p53突变的HCC。尽管这些新鉴定的RNA甲基化没有在HCC领域进行广泛的研究，但总体的研究思路与m6A修饰是一致的。

7 结语和展望

不同的表观遗传修饰如RNA甲基化可驱动HCC细胞的增殖、侵袭与转移。DNA甲基化与组蛋白甲基化已经有大量的研究基础，相应的酶抑制剂已经进入临床研究，但RNA甲基化修饰在HCC领域的研究才刚刚开始拉开帷幕，目前的研究方向主要定位于各种修饰酶的异常表达或相互作用，但这些甲基化酶或去甲基化酶在HCC中发生异常表达的机理研究甚少。此外HCC的高死亡率主要是由于复发和转移，而多数研究都表明异常表达的甲基化酶或去甲基化酶加速了HCC的转移或为HCC的转移提供便利，靶向这些酶类可能是抑制HCC转移的重要干预方式，对于延长患者生存期以及生存质量至关重要。鉴于RNA甲基化修饰是一个动态可逆的过程，逆转HCC中异常的RNA甲基化是否可以缓解HCC的进程是值得关注的问题。结合目前RNA甲基化在HCC领域的研究现状来看，RNA甲基化参与HCC可能的机制是参与RNA甲基化过程的多种酶发生了异常的表达，这些异常表达的酶与下游的转录因子相互作用影响mRNA合成过程，促进或抑制了HCC的发展。这也是目前研究RNA甲基化的普遍思路。由于对RNA甲基化的生物功能认识尚处于初始阶段，且新的修饰方式不断被发现，深入探讨RNA甲基化与HCC的内在联系是十分有意义的。