呼吸道微生态与疾病的研究进展

谢元辰 王兆娴 姚 武 赵 凯 王 娜

(郑州大学公共卫生学院,郑州450002)

共生微生物(微生物群)定植在人体表面及与外界相同的腔道内，其数量是人体自身细胞的10倍之多，携带的基因数量高达人体基因组的100倍[1]。自2007年底美国国立卫生院 (NIH) 宣布正式启动人类微生物组计划(Humanmicrobiome project,HMP)以来，众多研究发现微生物通过与宿主细胞的交互作用调节局部生理功能，与癌症、炎症、自身免疫性疾病、代谢类疾病甚至神经系统等疾病密切相关[2-5]，但目前研究多集中在肠道、阴道、皮肤菌群，对呼吸道菌群的研究还较少。

已有的研究显示呼吸道微生态受生命早期接触、遗传、宿主易感性、疾病等因素的影响[6-8]，并通过对机体代谢，细胞增殖，炎症和免疫系统的作用，影响人体健康和疾病的发展及转归。因此本文将从呼吸道微生态的基本情况、微生态研究技术及微生物与呼吸道疾病的关联性等三个方面展开讨论，并对基于微生态作为治疗手段的新思路新方法做出展望。

1 呼吸道微生态概述

呼吸道分为上呼吸道和下呼吸道，主要功能是进行氧和二氧化碳的交换。成年人气道的表面积约为70平方米，比皮肤表面积大40倍，整个表面都有特定细菌菌落定植，其中上呼吸道的细菌丰度最高[9]。2014年Dickson等[11]提出了一个岛屿模型，认为呼吸道微生态是一个梯度变化的过程，肺部的菌群与上呼吸道的相似性很低，且多样性和丰度也随着距离口咽部距离的升高而逐渐降低[10,11]。从上呼吸道开始，鼻孔以厚壁菌(Formicates)和放线菌(Actinomyces)为主；口咽部以厚壁菌、变形菌门(Mycetozoan)和类杆菌(Bacteroid)为主[12]；肺部则以拟杆菌属(Bacaeroides)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Mycetozoan)为主。其中鼻腔微生物群更接近皮肤菌群，对肺部微生态贡献很小[13]。

影响呼吸道微生态结构的原因有很多，其中起决定作用的是微生物进入和被清除(例如咳嗽或免疫防御)出气道的速度[11]，这对于解释健康的肺在中毒及精神状态改变的情况下，由于咳嗽减少而导致的肺炎有很大意义。除此之外，微生物的繁殖能力、肺部微环境(如温度、氧气张力、pH值、营养密度、局部解剖结构和宿主防御能力)、微生物的早期定植以及年龄都对肺部的菌群结构有很大影响[14,15]。

2 微生态研究技术

由于99%的人体微生物都是不能被培养的[16]，因此传统的菌种培养鉴定方法存在着很大的局限性。具体表现为无法区分许多在生理生化特征上相似的种属且不能完整地反映整个微生物群落的组成和动态变化。随着对rRNA小亚基和宏基因组测序的广泛应用，使得探明微生态结构、预测微生物功能和分析微生物作用靶点成为现实。

目前，在微生物领域里应用最为广泛的两种宏基因组测序策略分别是16S rRNA扩增子测序和全基因组测序。16S rRNA扩增子测序通过利用特定的“探针”锚定目标高变区的位置，并将对应的碱基序列进PCR扩增和测序[17]。测序完成后，将提取的碱基序列进行数据的预处理(包括测序质量控制、双端序列连接、混合样本)后，根据16S rRNA 基因序列的相似度阈值通过聚类分析而得到不同分类水平的分类单元(taxon)，并对其进行注释得到操作分类单位(OTU)，从而了解微生物的结构(包括丰度、多样性及不同群落的差异特征等信息)[18]。全基因组测序(WGS)则是将基因组 DNA “打断”成多个片段，对这些分子片段进行直接测序，然后将预处理(包括测序质量控制和“污染”序列剔除)后的数据进行分析，了解整个微生物群落的结构，包括功能组成、系统进化、生物多样性及不同群落的差异特征等信息，还可对重要物种及基因进行个性化分析[19]。

目前新出现的第三代测序技术已经开始崭露头角，其核心技术是单分子测序，无需进行PCR扩增，克服了第二代测序技术读长短及系统性错误等问题，实现了实时测序。在测序长度(平均读长可以达到8 kD～15 kD)、速度、通量、高CG含量及重复序列等复杂结构的测序方面有巨大的优势[18,20]。当测序深度达到70倍以上，经过平台自身及HGAP、pacbioCA、LSC、p-errormolule、PBcR等相关软件的矫正后，错误率可降低到0.1%以下[21]。

测序技术的发展虽然在很大程度上推动了微生态的研究，但由于研究菌群与宿主细胞间作用的机制仍然需要动物及细胞实验的数据支持，因此微生物的培养和纯化对微生物的研究具有不可替代的地位。近年来涌现了许多改善微生物培养的新方法，如稀释培养法(Dilution culture)[22]、高通量培养技术(High-throughput culti-vation,HTC)[23]、模拟自然环境的培养技术[24,25]、改良微生物培养基组成和培养条件[26]、设计新型的培养基等方法。除此之外，Matthew等还创建了一个基于细菌或古菌16S rRNA的序列预测目标微生物培养基配方的数据库-GROWREC，该数据库结合了NCBI的微生物分类和微生物培养基数据库(DSMZ)的数据，依据传递预测模式(Transitive prediction schema)和协同过滤预测(Collaborative filtering predictor)，根据已知物种培养基来推断其相似性高的近缘物种培养基，因此极大加速了从生态研究到微生物资源挖掘的进程[27]。

3 微生态与呼吸道疾病

3.1肺癌 随着测序技术的发展和应用，研究发现癌症与微生物之间具有复杂的调控关系，虽然癌症的危险因素通常被认为是宿主遗传学和环境因素，但实际上微生物约涉及20%的人类恶性肿瘤[28]。研究发现肺癌患者的微生物多样性显著低于正常人群，但链球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、韦荣球菌属(Veillonella)、巨球型菌属(Megasphaera)、厚壁菌门(Firmicutes)和TM7菌门的丰度却明显高于正常对照组[29]，进一步的研究发现金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌的感染是导致肺癌病人患败血症的主要原因[30]。

炎症级联反应的激活是肺癌发生的早期步骤，可刺激生长因子和细胞因子如TGF-β，IL-1和IL-8的合成[31]。一旦癌症形成，炎症还会进一步促进肿瘤的发生发展[32]。对大多数人来说，可以快速修复被破坏的屏障，使得内环境稳态得以恢复，但在宿主免疫力低下或微生物恢复力差的情况下会导致屏障的破坏和内稳态的失衡[33]。Gui等[34]利用Lewis肺癌小鼠模型在研究肠道微生物的抗肿瘤作用时发现，ABX(万古霉素，氨苄青霉素和新霉素的抗生素混合物)可以通过上调VEGFA的表达和下调BAX和CDKN1B的表达来部分损害顺铂的功能，但在顺铂联合乳酸杆菌共同治疗后发现小鼠CD8+T 细胞的 IFN-γ、GZMB和PRF1表达被上调，增强了顺铂的抗肿瘤生长和促凋亡作用，与此同时Boursi等[35]的研究也发现使用青霉素、头孢菌素或大环内酯类药物可通过破坏菌群的生态平衡而增加肺癌的患病风险。

细菌毒素还可以通过直接损害宿主DNA，促进肺癌的发生。研究发现细菌可以通过宿主产生的活性氧和氮物种直接或间接损伤DNA。当DNA损伤超过宿主细胞的修复能力时，细胞就会发生死亡或突变[36,37]。肺炎支原体是常见的呼吸道病原体，可调节宿主细胞的凋亡和生长。目前已经发现三种肺炎支原体损伤宿主DNA的机制：①肺炎支原体感染肺上皮细胞后，可通过炎症反应诱导活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)形成，利用ROS诱导DNA的损伤[38]；炎症导致的细胞损伤及修复可加快细胞的分裂速度，提升DNA突变的风险[39]；肺炎衣原体也是宿主单核细胞中IL-1β和IL-6的诱导剂，具有潜在的致癌作用[40]。Khan等[41]还进一步发现了肺炎衣原体的DNA核靶向序列，包括exonuclease V subunit RecB、ribonuclease R、exodeo-xyribonuclease VII small subunit和 exodeoxyribonu-clease VII large subunit，并且发现错配修复蛋白的改变可能与肺癌有关[41]。

3.2肺纤维化 肺纤维化属于肺间质病，早期表现为弥漫性炎症，后期则表现为成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质(ECM)进行性沉积[42]。肺纤维化是一种不可逆的肺部损伤疾病，最终可导致弥漫性间质性肺纤维化及肺功能的丧失，死亡率高达50%～70%[43,44]。

大量的动物和临床研究均证实细菌感染是引起急性肺损伤纤维化的重要原因，可引起气道上皮细胞的损伤和凋亡，调节宿主对损伤的反应能力[45]。在肺纤维化病人中，通过对细菌DNA高变区进行二代测序后发现，患病组的细菌丰度是对照组的两倍，且嗜血杆菌(Hemophilus)、假单胞菌(Pseudomxon-as)、球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococ-cus)、奈瑟菌属(Neisseria)、和韦荣球菌属(Veillonella)的丰度显著上升，结果显示这些菌群可潜在推动疾病的发展[46,47]。在针对小鼠的实验中发现，巨噬细胞功能的发挥和黏膜纤毛对细菌的有效清除均需要Muc5b糖蛋白的参与[48]，一旦黏膜纤毛清除功能受损会使得细菌在下呼吸道持续存在，使其作为一个潜在的启动器损伤肺泡，加速细菌感染，持续恶化病情。此外，还有研究指出肺炎链球菌可通过分泌肺炎球菌溶血素(ply)，破坏肺组织屏障并抑制免疫和炎症细胞的作用，驱动肺纤维化的发展。实验表明在小鼠感染肺炎链球菌后的24 h和48 h后，用克拉霉素或阿莫西林进行抗生素治疗，可显著降低羟脯氨酸含量，进一步证明了肺部微生态失衡是肺纤维化的一个致病因素[49]。

3.3慢性阻塞性肺疾病(COPD) COPD是最常见的呼吸系统疾病之一[50]，它包括慢性支气管炎、小气道疾病、黏液分泌过多和肺气肿等表型[51]，主要表现为持续的气道炎症，小气道闭塞和肺泡破坏导致的肺功能受损[52]。COPD常见的定植细菌有流感嗜血杆菌(H.influenzae)、卡他莫拉菌(M.cata-rrhalis)和肺炎链球菌(S.pneumoniae)[53]，但由于细菌菌群通常在菌株和菌种方面会发生变化，因此认为其定植细菌是动态变化的[54]，且急性的细菌或病毒感染通常被认为是COPD恶化的触发器[55]。临床数据显示，在急性COPD恶化期间用抗生素治疗7～10 d可以降低治疗失败和院内死亡的风险，说明细菌感染是导致COPD突然恶化的重要原因之一[56]。

目前，针对微生物在COPD炎症进展中的作用机制也有一些研究[57-59]。Richmond等[57]通过用免疫球蛋白受体缺陷型(pIgR-/-)小鼠构建的COPD模型发现，相比于正常的pIgR-/-小鼠，无菌的pIgR-/-小鼠体内缺乏分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)，不能推动气道重塑、肺气肿和炎症水平的升高，说明细菌介导了COPD的进展。Hinks等[60]发现未分型流感嗜血杆菌(Nontypeable-H.influenzae，NTHi)的感染可以诱导黏膜相关恒定的T淋巴细胞(MAIT)限制性分子MR1在肺巨噬细胞上的表达和MAIT细胞的IFN-γ应答。Millares等[61]对具有代表性的8个COPD患者的痰标本进行宏基因组测序和MG-RAST分析后发现微生物组的代谢能力在癌症和碳水化合物的代谢过程中显著上升，而在细胞的生长、死亡以及能量的运输和分解过程中则显著下降。可以看出微生物可通过多种途径影响COPD的发展和转归。

3.4哮喘 哮喘是一种由多因素引发的疾病，主要特征是气道炎症升高，平滑肌增生和气道高反应性[52,62]。传统观点认为室内的尘螨、蟑螂、老鼠、宠物以及室外的树木、草、花粉等过敏原都是致儿童哮喘的危险因素[63-65]。然而，最近从流行病学、临床资料以及小鼠模型中获得的研究数据均显示微生物在哮喘发病的过程中具有关键作用[66-68]。

在生命的头几个月，细菌的定殖对免疫系统的发育和平衡至关重要：它促进黏膜免疫应答的成熟，建立免疫耐受并在致病菌感染时帮助激活免疫系统[69-71]。Bisgaard等[72]对411名婴儿进行前瞻性研究发现，如果无症状新生儿在一月龄时呼吸道被肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、卡他莫拉菌(Moraxelle catarrhalis)中的一种或多种细菌联合定植，其首次发生持续性喘息和喘息急性发作的时间将会显著提前，且血液嗜酸性粒细胞计数上升和总IgE增加的风险会上升1～3倍，并且最终可能导致婴幼儿气道阻力的增加，增加婴儿患哮喘的风险[73]。研究提示：①婴幼儿肺部微生态结构的建立是一个动态过程；②微生物群与肺特异性免疫发展之间的关系是动态的。

不仅如此，呼吸道微生态还可以从多个方面影响哮喘的发展以及转归。Remot等[74]发现无菌小鼠和SPF级小鼠在同样的干预下，两组小鼠的疾病进程没有区别，进一步将从患病小鼠中筛选菌株联合致哮喘干预后发现，CNCM I 4969可防止肺部炎症，保护小鼠免于尘螨(House Dust Mice,HDM)诱导的气道疾病，而CNCM I 4970则会加重小鼠肺部的炎症。Depner等[75]则发现鼻腔中菌群多样性的减少会增加儿童患哮喘的风险，并且Gibson等[76]的研究则通过抗生素的治疗印证了这一结论，在一项随机、双盲、安慰剂病例对照研究中发现，对以长期吸入皮质类固醇进行治疗的哮喘患者(没有听力障碍或QTc的异常延长)，用阿奇霉素(500毫克，每周3次，持续48周)联合皮质类固醇治疗，可以降低哮喘急性发作的频率，提高生活质量。

4 微生态的应用的前景

目前，许多研究致力于将细菌作为生物标志应用于呼吸道系统疾病的早期诊断。针对肺癌的研究显示，在诱导痰中发现的肠球菌属(Enterococcussp)、中链球菌(Streptococcus intermedius)、大肠杆菌(Escherichia coli)、甲型链球菌(S.viridans)的丰度与肺癌的进展有关[77]，另一研究发现将唾液中的韦荣球菌属(Veillonella)和噬二氧化碳菌属(Capnocytophaga)的丰度作为指标联合判别是否患有肺癌[包括鳞状细胞癌和腺癌]，其ROC值达到0.86，灵敏度为84.6%，特异性为86.7%[77]。 在针对特发性肺纤维化病人的研究中也发现链球菌(Streptococcus)、普氏菌属(Prevotella) 和梭菌属(Fusobacterium)丰度的特异性上升也可以作为独立生物指标预测疾病的进展[10]。但由于这一类研究的样本量仍然较少，因此距离临床应用还有一段距离。

随着对微生物研究的深入，人们发现在免疫治疗领域拥有巨大的应用潜力[74,78,79]。研究发现“检查点抑制剂”作为一种唤醒免疫系统抵抗肿瘤的新型药物，在应用于临床治疗时却发现对部分病人没有效果，其中Vétizou等[80]用CTLA-4阻断剂(CTLA-4会影响人体的免疫系统，削弱其杀死癌细胞的能力)进行抗肿瘤治疗时发现，T细胞对拟杆菌(B.thetaiotaomicron)或脆弱拟杆菌(B.fragilis)的应答与CTLA-4的阻断功能相关，动物实验进一步显示用脆弱类杆菌(Bacteroides fragilis)对无菌小鼠或用抗生素进行干预后的小鼠进行管饲，可以改变其对CTLA-4阻断剂治疗没有反应的问题，同时，大量研究也发现CpG寡核苷酸免疫对小鼠皮下肿瘤的治疗效果在无菌小鼠和经过高剂量的抗生素处理之后的小鼠中被降低，这一现象在黑素瘤、膀胱癌、肾部癌症和肺癌的研究中也发现了类似现象，但在结肠癌(微生物丰度、多样性都很高)中却没有发现类似结果[57,81]，提示在临床应用“检查点抑制剂”治疗肿瘤时应考虑将微生物作为免疫治疗佐剂，提升免疫疗法的疗效。同时也提示除了基因组之外，微生物的个体差异会对疾病的发生、发展及治疗产生巨大的影响[82]。

用基因工程的方法(如对细菌基因组进行敲除、敲入或引入突变)，使外源基因得到高效表达的细菌一般称为“工程菌”，工程菌作为合成生物学 (Synthetic biology，SB)研究的一个重要领域，在医学中也有广泛的应用前景，可以作为“药物”的生产场所及运输载体对疾病进行治疗[83-86]。Ro等[87]创造了一种酿酒酵母菌株，其通过表达紫穗槐二烯合酶，启动焦磷酸法尼酯(Farnesyl pyrophosphate，FPP)的生物合成途径，增加FPP的产量，从而产出大量的青蒿酸(青蒿素前体)；与此同时，细菌在药物传送方面也有很大潜力，与已经用于癌症治疗的病毒相比，细菌携带非天然DNA的能力明显更强。因此，原则上细菌可以作为有效药物输送载体，携带基因电路(Genetic circuits)编码提升治疗的有效性[85]。Claesen等[88]采用模块化的设计策略，在体外利用大肠杆菌将大分子物质转染至癌细胞的细胞质。鉴于整个系统的高度复杂性，他们构建了五个功能模块：产生用于递送大分子的有效载荷装置(a payload device，PLD)，启动细菌入侵哺乳动物细胞的装置(Invasion device，ID)，响应于液泡微环境的液泡感测装置(Vacuole sensing device,VSD)，引起细菌裂解的自溶装置(Self-lysis device,SLD)和液泡裂解装置(Vacuole lysis device,VLD)，结果显示将各模块进行系统优化后的大肠杆菌能够将80%蛋白质靶向传送至癌细胞。工程菌治疗作为一个新兴的研究领域，虽然迄今为止已经设计了几个系统性的验证概念，但下一代的设计预计将更加复杂，包括诊断、信号集成、决策、复合生产、靶向递送以及安全模块[88]。

综上所述，微生态作为人体的第二套“基因组”，从方方面面影响着人体的健康，同时作为呼吸道疾病治疗的潜在靶点，具有重要的研究价值。但目前对于微生物与宿主相互作用的机制、免疫治疗的效果与微生态间的作用机制、如何建立一种安全、规范、操作性强的微生物移植方式及稀有菌群对人体的健康的作用等问题仍有巨大的研究空间。