丝素蛋白β-折叠含量影响细胞生长的研究

张媚 王富平 魏如男 陈忠敏

摘要： 分析在乙醇处理前后丝素蛋白（SF）与丝素肽（SFP）二级结构含量变化，及对细胞生长的影响。采用醇溶法提取制备SF，由中性蛋白酶酶解得SFP，40%乙醇分别处理SF与SFP，得ET-SF、ET-SFP。将SF、SFP、ET-SF、ET-SFP分别采用过滤除菌处理后再分别在1mg/mL、0.5mg/mL浓度条件下，检测其对人肝癌细胞（HepG2）、人宫颈癌上皮细胞（Caski）的生长影响，利用相对增值率评价其毒性，圆二色谱法检测二级结构含量。结果表明：乙醇处理前后SF为非浓度依赖型，对细胞生长均有促进作用且趋势相同;乙醇处理前后SFP为浓度依赖型，对细胞均有抑制作用，当β-折叠含量增加，SFP对细胞毒性作用增加。

关键词： 丝素蛋白;丝素肽;二级结构;细胞生长;细胞毒性

中图分类号： TS102.33   文献标志码： A   文章编号： 1001-7003（2019）05-0014-06   引用页码： 051103

Abstract： The changes in secondary structure content of silk fibroin （SF） and silk fibroin peptide （SFP） before and after treatment with ethanol， and the effects of different secondary structures on cell growth were investigated. SF was extracted and prepared by alcohol solution method， and then SFP was gained by neutral protease enzymolysis. SF and SFP were treated with 40% ethanol respectively to get ET-SF and ET-SFP. After filtration sterilization of SF， SFP， ET-SF and ET-SFP respectively， their effects on the growth of human liver cancer cells （HepG2） and human cervical cancer epithelial cells （Caski） were detected at the concentration of 1 mg/ml and 0.5 mg/ml， respectively. The Relative Growth Rate （RGR） was used to evaluate the toxicity. The secondary structure content was detected by Circular Dichroism （CD）. The results showed that SF was non-concentration-dependent before and after ethanol treatment and could promote cell growth， with the same trend. SFP was concentration-dependent before and after ethanol treatment and could inhibit the cell proliferation. In a conclusion， SFP enhanced the cytotoxicity with the increases of β-sheet content.

Key words： silk fibroin; silk fibroin peptide; secondary structure; cell growth; cytotoxicity

丝素蛋白（Silk fibroin， SF）是一种从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有良好的生物相容性、降解性和力学性能，被广泛应用于生物医学领域，如新型载药系统、细胞培养基质、医用生物敷料、固定化酶材料、组织工程支架[1-2]。作为组织工程支架时具有促进细胞在材料表面黏附的能力，当其在体内生理环境下发生降解时，产物以游离氨基酸和低分子多肽为主，可被细胞新陈代谢所利用，促进细胞增殖生长[3-5]，即经过降解的丝素蛋白带上了犹如生长因子类的作用，在组织工程支架领域具备了优异的特性。

SF是一种纤维状蛋白，由无定形区和结晶区构成，其结晶度一般在50%～60%，较大侧基的氨基酸主要存在于无定形部分，而极性氨基酸在无定形区中的含量比在结晶区中的含量多[6]。结晶形态又可分Silk Ⅰ型和Silk Ⅱ型，Silk Ⅰ型分子链主要由α-螺旋和无规卷曲交替堆积而成，结构不稳定;而Silk Ⅱ型主要为β-折叠片层状结构，且在温度和溶剂影响下Silk Ⅰ型容易向Silk Ⅱ型转变[7-9]。有研究发现将乙醇加入丝素蛋白溶液后，溶液中原有的少量β-折叠构象将受到破坏，由于乙醇分子与水分子结合使得丝素蛋白分子之间的相互作用增强，促使链段重新排列形成大量的β-折叠构象[10-12]。但是目前关于SF及丝素肽（Silk fibroin peptide，SFP）的二级结构变化与细胞生长作用影响的相关研究并不多见，因此本文尝试用40%乙醇处理SF，得到二级结构含量不同的SF与SFP，再将所制得的SF和SFP与细胞进行共培养，探究其对细胞生长的作用。

1 实 验

1.1 材料、试剂和仪器

茧壳（重庆市纤维织品检验所），酶活力20×104 U/g的中性蛋白酶（南宁庞博生物有限公司），人宫颈癌上皮细胞Caski、人肝癌细胞HepG2（上海中乔新舟生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM培養基、PRMI-1640培养基、HyClone（赛默飞世尔生物化学制品有限公司），氨苄青霉素、硫酸链霉素、MTT（北京Solarbio生物科技有限公司），SDS-PAGE凝胶配置试剂盒（Beyotime，碧云天生物技术公司），超低分子量蛋白电泳试剂盒（Real-Times，中科瑞泰（北京）生物科技有限公司），所用试剂无水乙醇、二甲亚砜（DMSO）等均为分析纯（市售）。

FD-1-50真空冷冻干燥机（上海比郎仪器有限公司），JY300E电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）。

1.2 丝素蛋白制备

按照文献[13]的方法，将废蚕茧除杂后，于04% Na2CO3溶液中沸煮两次，每次1.5h，水浴比为1 ︰ 30，以除去丝素纤维表面的丝胶蛋白。干燥后的丝素蛋白采用盐溶液溶解，配制CaCl2/C2H5OH/H2O（摩尔比1 ︰ 2 ︰ 8）的混合盐溶液体系，80℃水浴30min。将盐溶液经过滤、浓缩和冷冻干燥得到丝素蛋白粉末，密封保存备用，扫描电镜检测其线粒大小为20～50μm，此即为丝素蛋白（SF）。采用中性蛋白酶按照m纯丝素液 ︰ m中性蛋白酶=20 ︰ 1在pH6.0～7.0条件下55℃水浴酶解1.5h，制得丝素肽（SFP）。

将SF与SFP分别用40%乙醇溶液处理2h，冷冻干燥得到二级结构不同的丝素蛋白粉末，密封保存备用。

1.3 丝素蛋白相对分子质量的测定

电泳步骤按照碧云天生物技术公司说明书进行，配置15%分离胶与5%浓缩胶，先灌入分离胶，待分离胶聚合后再灌入浓缩胶，插入梳子，待胶聚合好后拔出梳子，上样，开始电泳。首先在80V条件下电泳1～2h，待指示buffer到达分离胶上沿时，将电压调至120V，直至buffer到达分离胶下沿，结束电泳。电泳结束后将胶层置于考马斯亮蓝染液中染色2h，再用脱色液进行脱色，得到清晰的蛋白质条带。再以相同步骤按照中科瑞泰（北京）生物技术有限公司说明书对SFP进行电泳。

1.4 细胞生长性能检测

HepG2细胞用DMEM培养基培养、Caski细胞用PRMI-1640培养基培养。配制质量浓度为4mg/mL的SF溶液，分别为SF溶液、ET-SF（乙醇处理后的丝素蛋白）溶液、SFP溶液、ET-SFP（乙醇处理后的丝素肽）溶液，采用过滤除菌法（微孔滤器，220nm，Millipore，Ireland）处理，在处理后用完全培养基分别稀释成质量浓度为2、1mg/mL。用血球计数板分别将三种细胞浓度调节为3×105个/mL，以每孔100μL加入到96孔板（Corning，USA）中，过夜待细胞贴壁后每孔加入100μL制备好的经不同处理的培养基（此时质量浓度为1、0.5mg/mL），以只加完全培养基的孔作为空白对照组，每组实验设置3个复孔，于37℃，5%CO2细胞培养箱（FORMA3111，美国Thermo公司）中培养。于5d后采用MTT法检测三种细胞的活性：每孔加入20μL MTT，于细胞培养箱中继续培养4h后，弃去96孔板中的液体，每孔加入150μL DMSO，使用酶标仪（Multiskan GO，美国Thermo公司）震荡10min，然后检测其在490nm处的吸光值绘制细胞生长曲线，并按照下式计算相对增殖率RGR。

根据毒性级别评价国家标准GB/T16886.5—2003《医疗器械生物学评价 第5部分：体外细胞毒性试验》，将RGR值转换为细胞毒性分级（表1）。

1.5 乙醇处理后丝素蛋白中二级结构含量的测定

采用圆二色光谱仪（英国APL Chiascan）检测蛋白二级结构，丝素蛋白质量浓度为0.1mg/mL，样品充分溶于水后上机进行测试。仪器参数：能带宽度1nm;响应时长1s;波长190～260nm;扫描速度500nm/min。

1.6 统计学处理

每组实验重复三次，采用OriginPro2016软件進行数据处理与分析。

2 结果与分析

2.1 SF与SFP的相对分子质量大小分析

实验采用SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳对SF与SFP的相对分子质量区间进行测定。图1（a）结果显示，电泳得到SF泳道相对分子质量形成了15～40kD的一个分布，而SFP泳道则不能看见明显的相对分子质量条带，因此再采用低相对分子质量蛋白电泳对SFP进行电泳测定，观察到在相对分子质量小于17kD有明显的条带形成（图1（b））。这是由于SFP的相对分子质量太小，因为中性蛋白酶可催化分解肽键，将大分子的蛋白质降解成为小分子的多肽或氨基酸物质[14]。此方法确认了制备出的丝素蛋白分别为相对分子质量大小不同的SF与SFP。

2.2 乙醇处理前后SF与SFP对细胞生长的影响

SFP是酶解产物，呈水溶性，可溶解分散于细胞培养基中，由于中性蛋白酶酶切位点无特定性，SFP产物即属于复杂的多肽、游离氨基酸混合物。SF溶于水后在水溶液中形成丝素蛋白胶粒[15]，SF由于粒径较大，会黏附在细胞的表面促进细胞增殖，且增值速率随着其与细胞贴壁面积的增加而增大;而对于粒径较小的SFP，能被细胞摄入胞内并对细胞内的物质代谢产生一定程度的干扰，从而抑制细胞的生长[16]。

以人的宫颈癌上皮细胞细胞（Caski）与肝癌细胞（HepG2）作为体外模型，分别将SF、ET-SF、SFP、ET-SFP对细胞生长的影响进行评估。图2显示SF与ET-SF对Caski和HepG2的生长均有明显的促进作用，且趋势相同，质量浓度对其影响较小，与理论相符。可见SF二级结构的变化对细胞生长的影响不大。

而对于SFP与ET-SFP，其对Caski和HepG2的生长均存在抑制作用，如图3所示。当SFP与ET-SFP质量浓度较低（0.5mg/mL）时，其对细胞增殖的抑制作用随着时间的增加显著增强;当SFP与ET-SFP质量浓度较高（1mg/mL）时，Caski和HepG2几乎不生长，说明SFP与ET-SFP对细胞增殖的作用具有浓度依赖性。对比乙醇处理前后SFP对细胞的影响，以0.5mg/mL为例，发现处理前的SFP对细胞生长虽有抑制作用，但在第5天时仍有细胞生长，而对于处理后的ET-SFP，其对细胞的抑制作用明显增强，且从第4天开始细胞趋于全部死亡。根据样品毒性级别评分对照表进行细胞毒性级别评分，ET-SFP的细胞毒性等级相比SFP而言明显增大，这说明乙醇处理使SFP的二级结构发生变化，导致其对细胞内的物质代谢干扰程度不同，因而导致细胞的增殖速度有明显差别，细胞毒性增大。

实验结果显示，SF与SEP对人肝癌细胞HepG2的生长的影响均大于人宫颈癌细胞Caski，这可能是由于HepG2细胞的增殖生长能力强于Caski细胞[17]，代谢能力强，导致在经过SF与SFP处理后，影响效果均较Caski大。

2.3 乙醇处理前后对SFP中二级结构含量的影响

通过上述细胞实验发现，乙醇处理前后，SF对细胞生长的影响变化不大，而SFP变化明显，因此采用圆二色谱对SFP进行二级结构结构分析。圆二色谱是一种被广泛应用于生物大分子的结构和功能研究的测定技术，可以有效检测蛋白质二级结构的变化[18]。图4为所得圆二色谱，在190～240nm波段为远紫外区扫描范围，是肽键的吸收范围，反映蛋白质分子主链的二级结构比例[19]。采用CONTIN程序和Yang-chen公式对其二级结构成分进行分析。

乙醇是一种质子型有机溶剂，且乙醇分子能与丝素蛋白的疏水部分相互结合[9]，使蛋白质介电常数和表面水合层遭到不同程度的破坏[20]，致使蛋白质分子相互接触形成较大的粒子而从溶液中析出，引起蛋白变性、β化[21]。Yang等[22]认为丝素蛋白呈无规卷曲状态的部分在水溶液中会形成一定的疏水区域，乙醇的加入將削弱疏水侧链之间的相互作用，从而引发丝素蛋白由无规卷曲向β-折叠构象转变。表2结果显示，乙醇处理对丝素肽的二级结构变化影响明显，使α-螺旋和无规卷曲向β-折叠构象转变，且β-折叠含量由48.76%升高到55.16%，并且随之细胞毒性增强。有研究发现乳铁蛋白B能够杀死小鼠和人肿瘤细胞系的主要原因，就是由于该肽在水溶液中形成扭曲的β-折叠结构[23]。β-折叠较多时，原先包裹在蛋白质内部的疏水基团将被暴露在蛋白表面，从而使其能够插入到细胞膜脂质双层的疏水区，进而破坏细胞膜结构，最终导致细胞变形、聚集和破裂[24]。故SFP中β-折叠结构的增加导致细胞毒性的增强。

3 结 论

实验结果表明，对于丝素蛋白，因其相对分子质量太大，不能进入细胞内部，因此对其进行结构改变对其细胞毒性影响不大;而对于相对分子质量较小的丝素肽，其细胞毒性为浓度依赖型，且乙醇处理后其毒性变化较大，这是由于乙醇处理后，丝素肽的二级结构发生了改变，β-折叠含量显著增加，细胞毒性增加。

本研究为丝素肽的制备工艺检测过程提供了思路，建议在制备丝素肽时，要格外注意其条件控制，以避免二级结构中β-折叠含量增多引起的细胞毒性增加，同时为进一步研究丝素肽对细胞作用影响奠定了实验基础。

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