云南三种野生食用菌多糖提取工艺优化及其对比分析

魏晓梅 王 瑞 吴丽芳 柏旭 阮小娟 蔡清林

（1曲靖师范学院生物资源与食品工程学院，云南曲靖655011；2曲靖师范学院云南高原生物资源保护与利用研究中心，云南曲靖655011）

鸡油菌（Cantharelles cibarius）属真菌界担子菌门担子菌纲鸡油菌目鸡油菌科鸡油菌属（Cantharellus）的模式种[1]，含多种矿物质营养[2]，在日本被称为“植物食品的顶峰”，其多糖有美容及其抗衰老的功效[3]。鸡菌Termitornyces albuminosus（蚁巢伞），是一类特异性的与白蚁共生的食用菌，王思芦等发现鸡菌多糖对小鼠细胞免疫功能有显著的增强作用[4]，且能够明显提高脾淋巴细胞增殖能力及免疫抑制小鼠体液及细胞免疫功能，这种能力优于黄芪多糖的效果[5]。青头菌（Russula virescens）属担子菌纲（Basidiomycetes）红菇科（Russulacese）红菇属（Russula）[6，7]，因其独特浓郁的鲜香味及其丰富的矿质元素[8]和氨基酸含量[9]深受人们的欢迎。

真菌多糖是一大类生物活性物质，主要从真菌子实体或菌丝体及发酵液中分离出，由10个以上β-1，3糖苷键和β-1，6糖苷键连接而成，在国际上被称为“生物反应调节剂”[10]，对医药科学、生命科学的研究有重要意义。研究表明，真菌多糖具有抗菌，抗病毒，帮助心血管系统、降血糖等功效[11，12]。我国已经发现有重要价值的真菌多糖就有近30种[13]，许多研究人员已从药用真菌中用各种方法分离提取到了有生物学活性的多糖[14]，其中热水浸提法为常用的真菌多糖提取方法。常昕等发现最佳提取博湖蘑菇多糖的水提醇沉提取工艺为：100℃提取3.5 h，液固比35∶1，多糖提取得率高达20.02%[15]。

研究以采集自云南省不同地方的三种野生食用菌子实体为原材料，研究其多糖提取的最佳工艺，并在此基础上比较其粗多糖提取率，为野生食用菌的基础研究提供一定的数据支持，为食用菌生物活性物质的功能研究及其相关产品的进一步开发提供一些可参考的依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.2 试剂与设备

无水乙醇（天津市风船化学试剂科技有限公司生产，分析纯），三氯甲烷（南阳市科龙化工试剂厂生产，分析纯），正丁醇（天津市风船化学试剂科技有限公司生产，分析纯），丙酮（天津市化学试剂三厂生产，分析纯），离心机（大地自动化仪器厂制造，80-1离心机），高速组织捣碎机（上海标本模型厂制造，DS-1），电子天平 CP114（奥豪斯仪器（上海）有限公司制造，精确度等级Ⅰ），数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂制造，GZX-9070 MBE），微波炉（格兰仕微波炉电器有限公司效率值58%），DK-S26电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司制造）。

1.3 试验方法

精确称取粉末2 g，按照正交设计组合（表1）的条件，4000 r/min离心10 min，取上清，离心2次，合并上清液，沉淀中分别加入20、30、40倍蒸馏水，重复上述过程2次，合并上清液。用Sevag（氯仿∶正丁醇=4∶1）法除蛋白质。按1∶3的量加入Sevag试剂充分混匀蛋白质，置于具塞试管中，充分振摇20 min后放入锥形瓶中静置30 min，4000 r/min离心10 min。重复上述过程3次，旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，待浓缩液冷却后往浓缩液中分别加入无水乙醇，使浓缩液中乙醇浓度达到预先设计的量，4℃低温静置12 h醇沉，4000 r/min离心10 min，分离乙醇与沉淀旋转蒸发浓缩至原体积的1/3，待浓缩液冷却后往浓缩液中分别加入无水乙醇，使浓缩液中乙醇浓度达到预先设计的量，4℃低温静置12 h醇沉，4000 r/min离心10 min，分离乙醇与沉淀。醇沉结束后往水层中加入乙醇，使乙醇的量达到75%进行沉淀，去除水层并用丙酮进行洗涤。沉淀物在80℃的鼓风干燥箱中进行干燥，待干燥后称量所得的粗多糖。

以真菌多糖的提取含量为指标，研究浸提时间、浸提温度、料液比这三个因素在不同水平上对多糖提取结果的影响进行探讨，以确定提取真菌多糖的最佳条件。

1.4 多糖得率计算方法

多糖得率（%）=提取得到的粗多糖质量（g）/子实体原料质量（g）×100

表1 正交设计因素与水平（楚雄青头菌和鸡油菌）

表2 正交因素与水平（马龙鸡菌）

表2 正交因素与水平（马龙鸡菌）

水平1 2 3 A浸提时间/h 2 2.5 3 B浸提温度/℃60 70 80 C料液比1∶20 1∶30 1∶40

2 结果与分析

2.1 楚雄青头菌子实体粗多糖提取结果

提取结果见表3。不同条件下粗多糖得率存在差异，提取因素水平组合为A3B2C1时，粗多糖得率最高为6.18%；A1B1C1时，多糖得率最少，粗多糖得率仅为5.72%。根据各因素在相同水平下每克子实体材料提取粗多糖得量的和计算出K1、K2和K3，并得出相应的极差RⅠ值。分析RⅠ值发现对提取率影响B＞A＞C，即浸提温度＞浸提时间＞料液比，其中因素B（浸提温度）RⅠ值为0.0059，对楚雄青头菌子实体粗多糖提取率影响最大。其次是因素A（浸提时间），其RⅠ值为0.00515，且在浸提时间为3 h时，粗多糖得率最高。因素C（料液比）RⅠ值为0.00115，对多糖得率的影响最小。分别分析A、B、C 的K1、K2和K3，发现AK3，BK2，CK3最大，因此当浸提温度为75℃，浸提3 h（即A3B2C3）时，楚雄青头菌粗多糖的提取率最高，即最佳提取方案A3B2C3即料液比1∶40，75℃条件下浸提3 h。

表3 野生楚雄青头菌提取粗多糖正交设计试验结果

2.2 楚雄鸡油菌子实体粗多糖提取结果

结果见表4。因素水平为A3B2C1时，粗多糖得率最高为6.085%；A1B1C1时，多糖得率最低，粗多糖提取率为4.89%。根据各因素在相同水平下的粗多糖得量的和计算K-1、K-2和K-3及其对应的RⅡ。分析RⅡ，各因素对提取结果的影响程度为B＞A=C（浸提温度＞浸提时间=料液比），因素B（浸提温度）RⅡ为0.0184，对提取率的影响最大。分别分析A、B、C的K-1、K-2和K-3，发现 AK-2，BK-2，CK-1最大，因此最佳提取楚雄鸡油菌子实体粗多糖的组合为A2B2C1即75℃浸提2.5 h，料液比1∶20。

2.3 马龙鸡菌子实体多糖提取结果

试验结果见表5。在9个试验组合中，最佳的组合为A1B3C3，多糖得率最高，为4.08%。将各因素在相同水平下的粗多糖得量加和计算K1、K2和K3及其对应的Rj，各个因素对马龙鸡菌子实体粗多糖提取率影响的大小顺序为B＞C＞A，即浸提温度影响最大，浸提时间的影响次之，料液比影响最小。根据每个因素提取结果进行详细对比，发现最佳提取马龙鸡菌子实体粗多糖组合为A1B3C1，即80℃浸提2 h，料液比1∶20。

表4 野生楚雄鸡油菌提取粗多糖正交设计试验结果

表5 野生马龙鸡菌提取粗多糖正交设计试验结果

表5 野生马龙鸡菌提取粗多糖正交设计试验结果

试验号123456789K1K2K3K1 A 111222333 B 123123123 C 123231312每克子实体提取粗多糖/g 0.0270 0.0269 0.0408 0.0221 0.0195 0.0393 0.0153 0.0283 0.0335粗多糖提取率/%2.70 2.69 4.08 2.21 1.95 3.93 1.53 2.83 3.35 K2∑=0.2527 K3优水平Rj 0.0947 0.0809 0.0771 0.0316 0.0270 0.0257 A1 0.0059 0.0664 0.0747 0.1136 0.0221 0.0249 0.0379 B3 0.0158 0.0946 0.0825 0.0756 0.0315 0.0275 0.0252 C1 0.0063主次顺序B＞C＞A

2.4 三种野生菌子实体粗多糖提取最佳方案及其粗多糖提取率比较

对比楚雄青头菌和鸡油菌，通过正交分析表，二者粗多糖最佳提取因素上对于温度的要求类似，75℃为最佳提取温度；浸提时间和料液比则有所差异：楚雄青头菌子实体粗多糖最佳提取工艺为75℃浸提3 h，料液比1∶40，楚雄鸡油菌子实体粗多糖最佳提取方案为75℃浸提2.5 h，料液比1∶20。马龙鸡菌最佳提取工艺为80℃浸提2 h，料液比1∶20。因此对比浸提温度，楚雄青头菌及其鸡油菌子实体粗多糖提取最佳温度为75℃，而马龙鸡菌子实体粗多糖提取所需的最佳温度较高，为80℃。

在正交试验中，楚雄青头菌粗多糖提取率最高为6.18%，楚雄鸡油菌子实体粗多糖提取率最高为6.085%，马龙鸡菌子实体粗多糖提取率最高为4.08%，马龙鸡菌粗多糖提取率低于供试其它两种野生菌。由此推测，马龙鸡菌粗多糖含量可能较低于楚雄青头菌、楚雄鸡油菌，楚雄青头菌粗多糖含量在这供试三种野生食用菌中最高，可能与这三种野生食用菌本身的遗传特性相关，该推测还需进一步的试验分析和验证。

3 讨论

目前，野生食用菌子实体多糖相关研究越来越受到重视，其人工培养技术也在不断研究探索，若在人工培养过程中考虑到其生存环境与多糖积累之间的关系，并进一步分析确定其多糖结构[16]，据此开发出食品添加剂、抗肿瘤药物，将具有极高的经济效益和社会效益。试验结果将为这些野生菌开发研究提供一定参考[17]。