中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)及其在相关炎性疾病的研究进展①

曹维嘉 邵子玮 段孟洮 高玲玲 张有成 徐小东

(兰州大学第二医院普通外科，兰州 730000)

中性粒细胞作为人体免疫系统的重要防线，在机体免疫应答时发挥着极为关键的作用。机体受到病原体入侵时，中性粒细胞迅速聚集在损伤组织，通过吞噬和脱颗粒作用杀灭侵入的病原微生物。2004年Brinkmann等[1]首次发现，活化的中性粒细胞还可以通过释放中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs)来参与捕获并杀灭病原菌。NETs组成成分复杂，多种参与炎症反应的蛋白附着于其网状结构[1-4]。近年来多项研究发现NETs的产生与多种炎性疾病的发生和进展密切相关。本文主要介绍了NETs的主要成分、作用、形成方式、检测指标以及其在相关炎性疾病中的研究进展。

1 NETs的主要成分及作用

NETs是活化的中性粒细通过不同的方式向细胞外释放的高浓度网状DNA复合物，除了去聚化的染色质DNA外，其网状结构上主要黏附着瓜氨酸化组蛋白(CitH3)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、髄过氧化物酶(MPO)、长正五聚蛋白(PTX-3)、抗菌肽LL-37等30多种蛋白和酶。研究发现脱氧核糖核酸酶(DNase)能够直接破坏染色质DNA迅速降解NETs，证明去聚化的胞外染色质DNA是NETs最为重要的成分[1]。

研究表明，NETs除了杀灭病原菌外，还可以导致组织损伤并参与多种疾病的发展。NETs的这些生理作用与其组成成分密切相关。具有细胞毒性的细胞外组蛋白作为NETs的主要成分，能够破坏内皮细胞、水解蛋白质参与组织损伤。精氨酸脱亚氨酶4(PAD4)介导组蛋白的瓜氨酸化更是NETs形成的关键步骤[2]。NE和PR3等丝氨酸蛋白酶通过切割毒力因子或裂解惰性前体蛋白抑制微生物的生长。有研究发现NE还可以抑制组织因子(TFPI)，促进血管内纤维蛋白屏障的生成[3-5]。具有氧化活性的MPO不仅可以与活性氧(ROS)相互作用刺激NETs生成，同时还可以通过产生次氯酸杀灭病原菌。最近，有研究人员发现NETs上的P因子和补体C3可以将其捕获的病原微生物呈递给其他具有杀菌作用的细胞，从而共同限制机体炎症发展[6]。当体内NETs生成过量时，长正五聚蛋白(PTX-3)能够减轻组蛋白导致的损伤，调控体内NETs含量[7]。镶嵌于NETs的分泌性蛋白酶抑制因子(SLPI)亦能够调节NETs介导的组织损伤。此外，有研究发现SLPI作用于树突状细胞而诱导产生的Ⅰ型干扰素(IFN1)参与了系统性红斑狼疮(SLE)和牛皮癣等疾病的发病[5]。

2 NETs的形成方式

中性粒细胞形成NETs的方式被命名为 NETosis。研究证实，不同的刺激物作用于中性粒细胞后NETs的形成方式有所不同。

(1)研究发现中性粒细胞受到佛波酯(PMA)或IL-8等物质刺激后，在NADPH酶生成的活性氧(ROS)和钙离子作用下，PAD4介导组蛋白瓜氨酸化导致染色质的去聚化[8]。同时，ROS作为第二信使作用于MPO协同NE和LL-37易位至细胞核，导致核解聚和核膜破裂。随后胞质中具有杀灭病原微生物功能的各级颗粒和核染色质的融合物被排出到细胞外构成NETs的基本结构，这一过程长达1～4 h[9]。区别于既往的坏死和凋亡，NETs的形成伴随着中性粒细胞死亡的方式被称为Suicidal NETOsis。Raf-MEK-ERK通路和ROS的激活在其形成过程中扮演了关键角色[10]。

(2)Yipp等[11]在2012年通过活体显影可视技术发现，金黄色葡萄菌在急性感染期能够更为迅速(5～60 min)地刺激NETs产生。不同于Suicidal NETosis，中性粒细胞细胞膜上的TOLL样受体或C3补体被金葡菌或TRL-4活化血小板等物质识别后，核DNA随即以出芽的方式被包裹成囊泡释放。同时，不同的胞质颗粒则聚集在囊泡周围被一同排出胞外，此时胞内核膜保持完整，活化的中性粒细胞并不死亡且仍然保持着吞噬和趋化作用。NETs的这种形成方式被命名为Vital NETosis，其形成过程不依赖于Raf-MEK-ERK通路和ROS[10,12]。最近有研究表明血小板中活化的糖蛋白作用于中性粒细胞上的CD18黏附分子后，可以分别通过激活ERK、PI3k和SRC酶刺激PMN发生vital NETosis[13]。

(3)Yousefi等[14]发现在脂多糖(LPS)和C5a刺激后，中性粒细胞内的线粒体DNA在ROS作用下可以产生NETs，这一现象发生在更短的时间(15 min)内。NETs的形成过程中同样不伴随中性粒细胞的死亡，其调控机制尚不清楚。

3 NETs的检测指标

由于结构的复杂性，NETs尚无统一的检测指标和方法，目前主要通过检测其特异成分的表达以确定存在。由中性粒细胞产生的游离胞外DNA(Cell-free DNA)作为NETs的主要成分，经常被用来检测NETs的存在。该检测方法的局限性在于不能与巨噬细胞产生的少量Cell-free DNA进行区别[15]。PAD4介导的citH3被认为是NETs形成的标志物，因此被广泛运用于检测NETs的表达。需要注意的是，有报道称部分NETs的形成可能并不依赖于PAD4[16]。最新的研究表明，citH3还可以作为部分肿瘤早期诊断和判定预后的潜在指标[17]。在底物酶和不同抗体作用下标记的DNA和胞外蛋白DNA-NE、DNA-MPO共定位复合物由于具有高度特异性，因而在NETs的检测中最具有代表性[15]。

4 NETs与炎性疾病

4.1NETs与痛风关节炎 痛风关节炎是一种由过度饱和的针状尿酸盐结晶(MSU)沉积在关节引发的自限性急性炎症，MSU晶体刺激中性粒细胞聚集和活化是引发痛风急性发作的关键。MSU晶体与NETs的相互作用进一步揭示了痛风关节炎的发病机理。研究证实痛风患者滑膜液中充满白介素IL-1β、IL-18、MSU晶体以及中性粒细胞[18]。Mitroulis等[19]在痛风滑膜液中发现了染色的dsDNA和MPO等NETs组分。滑膜液中的MSU晶体可以通过刺激中性粒细胞发生NETosis和炎症反应。同时，巨噬细胞NLPR3 炎性体分泌的IL-1β可以通过增强MSU晶体作用，刺激中性粒细胞产生更多的NETs。过量的NETs与伴随其释放的有害颗粒蛋白可能共同加剧了炎症症状[20]。最近有研究证实NETs参与了痛风关节炎的缓解。随着NETs的大量积累，高浓度的NETs黏附形成特殊聚合网状结构aggregated NETs(aggNETs)。Schauer等[21]研究表明aggNETs能迅速捕捉促炎因子和趋化因子，通过降解促炎介质的水平和抑制中性粒细胞的聚集限制急性期炎症加重。aggNETs上大量暴露的丝氨酸蛋白酶参与了这一过程。另外，急性炎症末期白色的aggNETs还可以覆盖在MSU结晶表面将其与炎症介质隔离，促使其形成成熟的痛风石，从而完全停止对机体的急性损伤。

MUS诱导NETs生成的分子及其调节机制目前尚不完全清楚。NADPH氧化酶缺乏的大鼠中性粒细胞被MSU刺激后NETs和aggNETs不能形成，提示NADPH氧化酶参与了这一过程[21]。Desai等[22]通过RIPK1、RIPK3、MLKL的抑制剂分别阻止MUS刺激NETs生成后，ROS的产生并未受到影响，提示NETs的形成可能涉及ROS下游的RIPK1-RIPK3-MLKL信号凋亡途径。最近，Arai等[23]发现可溶性尿酸独立于NADPH氧化酶刺激生成了NETs，表明痛风中NETs的生成机制可能是复杂多样的。嘌呤P2Y6受体也被证实参与了痛风发作时NETs的形成。Sil等[24]通过实时成像技术发现，P2Y6特殊抑制剂MRS2578能够减少PMN的聚集，阻止aggNETs的生成，其机制可能与抑制ROS和促炎因子IL-8释放有关。最新的研究显示，吞噬细胞可以通过吞噬微小的尿酸盐聚合体SMA，阻止循环中MSU结晶及NETs的生成[25]。

4.2NETs与胰腺炎 胰腺炎是由多种病因引起胰酶大量分泌而导致的胰腺自身消化、水肿、出血及坏死的炎性疾病，目前尚无特效的治疗手段。炎症介质和胰蛋白酶释放发生紊乱被认为是炎症发生和加重的关键[26]。Merza等[27]的体内体外研究表明，NETs参与了胰腺炎的病理生理过程。在建立的重症急性胰腺炎(SAP)模型大鼠胰腺内，研究人员通过免疫荧光技术观察到了大量NETs的产生，而体内循环中cfDNA浓度和CitH3的表达增加证实了NETs的产生。通过在模型大鼠体内注射脱氧核糖核酸酶(DNase)预处理中性粒细胞降解NETs，减少了腺泡细胞以及胰腺组织的损伤。在此之前，高表达的组蛋白已经被证实参与了胰腺炎时胰腺组织损伤[28]。随着NETs的降解，DNase酶还降低了包括CXCL2、IL-6、HMGB1在内的多种炎症介质和蛋白酶的浓度。体外实验发现，NETs还能够直接作用腺泡细胞激活胰蛋白酶和STAT3信号通路，其机制可能与NETs产生时NADPH酶大量形成有关[27,28]。Moritz等[29]在IL-17基因过度表达诱发的胰腺炎小鼠体内发现了大量PAD4介导的CitH3和NE。PAD4基因敲除小鼠和野生型小鼠相比，PAD4基因缺乏小鼠基本不能被IL-17诱导发展为胰腺炎。这可能与PAD4基因缺乏导致的组蛋白不能瓜氨酸化相关。IL-17等炎症因子诱导中性粒细胞向胰腺胰管聚集，而导管中的碱性环境和大量的Ca离子是PAD4表达上调的重要条件。进一步的研究发现，聚集在胰腺导管内的嗜中性粒细胞受到胰液中的碳酸盐的刺激后，通过释放胞外染色质缠绕的aggNETs亦可以阻碍胰液分泌激活胰蛋白酶。这些现象提示NETs可能参与了胰腺炎的发病机制。因此调控体内NETs的生成可能成为治疗胰腺炎的潜在手段。

4.3NETs与其他炎性疾病 ①2型糖尿病患者往往涉及中性粒细胞计数增加和吞噬功能障碍等慢性炎症的表现，高血糖患者体内炎症细胞产生的氧化应激环境和炎症因子有利于NETosis 的发生。研究证实糖尿病模型大鼠的中性粒细胞被PMA刺激后更容易出现NETs，其体内PAD4的表达相较于正常组上升4倍[30]。此外，相较于健康人群，糖尿病患者体内dsDNA和NE等NETs的内容物含量明显增加，其增加程度和糖化血红素(HbA1c)以及IL-6浓度呈正相关[31]。②糖尿病视网膜疾病和视网膜静脉阻塞等眼部疾病会导致视力下降甚至丧失，视网膜细胞分泌的炎症因子IL-8和TNF-α被证实参与眼部炎症发病环节[32]。研究人员在视网膜脱落患者的玻璃体中发现了CitH3。NETs的细胞毒性作用归咎于组蛋白成分，其可以防止胞外DNA的降解和损伤微血管[33]。Barliya等[32]在向大鼠眼部注射白介素IL-8和TNF-α 24 h后，首次在大鼠眼部观察到CitH3。而大鼠眼部注射DNAse 酶后，染色的CitH3发生降解，NETs随即消失。随后研究人员在增生型糖尿病视网膜病变的患者眼部同样发现了NE-MPO和CitH3-MPO等NETs的主要成分，由此证实NETs可能参与了眼部疾病的炎症反应[32]。

5 结语

自发现NETs的十余年来，有关NETs的研究成为炎性疾病研究的热点。近年来国内外的研究表明，NETs除了能消灭病原微生物外，还从多个方面参与并影响了炎性疾病的病理生理过程。虽然NETs在这些疾病中的具体作用机制及信号通路的研究尚处于起步阶段，但已有的研究结果提示我们，对NETs在炎性疾病中的作用进一步研究，完善NETs的相关调控机制，可能会为今后炎性疾病的治疗方案和特异性靶点药物的开发提供新的发展思路。