滤泡辅助性T细胞(Tfh)在乳腺癌中的作用①

马林晓曦 张晓明 吴 炅

(复旦大学附属肿瘤医院乳腺外科，上海市乳腺肿瘤重点实验室，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032)

T淋巴细胞在机体免疫应答中发挥重要作用。按照表面标志物和功能，可将其分类，主要有：①CD4+辅助性T细胞(helper T cell,Th)：通过协助其他免疫细胞发挥免疫应答功能；② CD4+调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)：特异性表达转录因子Foxp3，通过负调控机体免疫反应，维持自身免疫系统的稳定；③ CD8+细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)：通过特异性杀伤靶细胞，在抗感染和抗肿瘤免疫应答过程中发挥重要作用。

按照分泌细胞因子的不同，Th细胞可进一步划分为Th1、Th2、Th17等亚群。滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cell,Tfh)是一类特殊的Th细胞，以程序性死亡受体1(Programmed cell death protein 1,PD-1)、CXC趋化因子受体5(C-X-C chemokine receptor type 5,CXCR5)、可诱导协同刺激分子(Inducible co-stimulator,ICOS)、B细胞淋巴瘤6蛋白(B cell lymphoma 6 protein,Bcl-6)、CXC趋化因子配体13(C-X-C motif chemokine ligand 13,CXCL13)、白细胞介素21(Interleukin 21,IL-21)为主要标志物，近年来引起许多科学家的重视。现有研究表明，Tfh细胞或类Tfh细胞(Tfh-like cell)的浸润与自身免疫疾病、获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)及乳腺癌等多种肿瘤的预后相关[1-6]。本文总结了Tfh细胞的分布和功能，主要对乳腺癌中Tfh细胞的表型、功能以及在预后价值做一综述，以阐述Tfh细胞在乳腺癌中的作用。

1 Tfh细胞的定位及功能

Tfh细胞最初发现于人类扁桃体，是一群高表达CXCR5的CD4+T细胞[7]。研究发现，健康人外周血中也存在CD4+CXCR5+T细胞，这群细胞在CXCL13的趋化作用下，迁移至B淋巴滤泡，因此Tfh细胞正常状态下主要定位于淋巴组织，协助B细胞执行功能。Tfh细胞同时高表达PD-1、ICOS、Bcl-6，分泌IL-21，参与调控B细胞的活化、抗体类型转换以及生发中心的形成[8,9]。位于生发中心的Tfh细胞通过分泌CXCL13，介导特定T细胞以及B细胞的迁移，实现对B细胞增殖分化的调节[1,10]。Tfh细胞通过表达核心转录因子Bcl-6，可抑制其他Th细胞亚群的分化。Tfh细胞表面标志物和细胞因子的表达有别于已有研究的Th1、Th2、Th17等Th细胞亚群，而其在疾病状态下的表达差异也受到广泛关注。

2 免疫细胞的检测方法

Tfh细胞作为一种免疫细胞，其研究方法与其他免疫细胞类似。目前对免疫细胞的研究，主要分为定位、定量及定性实验。下文以T细胞为例，概述免疫细胞状态和功能的常用研究方法。

2.1 流式细胞术 流式细胞术(Flow cytometry,FCM)是一种对液流中排成单列的细胞或其他生物微粒进行快速定量检测的技术，也是目前免疫细胞研究的重要方法。如由乳腺癌组织或外周血制成的细胞悬液，流式细胞仪可根据细胞性质和表面抗原的不同，对T淋巴细胞亚群进行进一步划分。按照细胞处理方式的不同，既可以分析表面标志物，也可以测定细胞因子的表达或测定功能指标，进行定量及定性研究[11]。

2.2 酶联免疫吸附试验及荧光定量PCR 酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是利用抗原抗体的特异性结合进行定量检测的方法，可以直接检测细胞因子，也可以测定细胞培养液中细胞因子的水平。由于ELISA无法检测混合体系中单一细胞的信息，在研究特定细胞功能时，可首先利用FCM分选出单一细胞再利用ELISA检测[12]。

除了利用FCM或者ELISA对细胞因子进行测定，也可利用各种印迹法、斑点杂交、原位杂交和聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)等技术来检测细胞因子的DNA或RNA。其中实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)基本不需要任何的体外刺激步骤，是一种非常敏感的细胞因子检测技术[12]。

2.3 免疫组化 免疫组化是研究淋巴细胞的经典方法，即利用组织标本和细胞标本制片，通过抗原抗体反应来显示组织内相应细胞的表达情况。按照标记物的种类，主要有免疫荧光细胞技术、免疫酶细胞化学技术、免疫胶体金技术等。免疫组化技术除了可以实现对淋巴细胞的定位，还可以定量研究。受限于细胞亚群表面标志物的共表达，传统的免疫组化技术可同时研究的免疫细胞种类非常有限，但是多色免疫荧光技术的出现，拓宽了免疫组化在免疫细胞领域的应用前景。如利用乳腺癌石蜡切片，多色免疫荧光技术可以通过同一张切片上多种抗体的共表达来确定T细胞亚群，实现组织原位观察，进行组织原位类流式分析[3,13]。

3 Tfh细胞在乳腺癌中的表型

Tfh细胞是机体免疫反应特别是体液免疫应答的重要调节因素，在AIDS、自身免疫性疾病中存在特殊意义[2,6,14]。同时，越来越多证据显示，Tfh细胞标志物的表达与多种癌症相关[1,3]。然而，不同于生发中心以PD-1hiCXCR5+ICOS+Bcl-6+IL-21+CXCL13+为特征的Tfh细胞，乳腺癌组织中的Tfh细胞表型呈现为PD-1hiCXCR5-ICOSintBcl-6int，同时分泌IL-21、CXCL13[1,13]。同样有证据显示，肝癌中Tfh细胞表面标志物与正常Tfh细胞不同，主要以PD-1lo/-CXCR5-BTLA-CD69hi为代表，并分泌IL-21[3]。为区别于正常淋巴组织中的Tfh细胞，有研究称其为Tfh-like细胞。证据显示，乳腺癌Tfh-like细胞除上述特征外，大多呈CD45RA-，并且存在CD200hiTIGIThiFAShiCTLA-4+CCR7-的表达，而基因水平高表达CXCL13、IL-21、IFNG、TBX21、BCL6，低表达FOXP3[1]。在乳腺癌肿瘤引流淋巴结(Tumor draining lymph node,TDLN)中，则存在CXCR5+Bcl-6+Foxp3-的CD4+T细胞，被认为是Tfh细胞[15]。

这些标志物的表达差异，意味着癌症状态下免疫调控的改变，有望在其中为疾病的诊断和治疗寻找新的作用靶点。以下简述这些细胞分子标志物的背景及其在肿瘤中的研究进展。

3.1 PD-1 PD-1是一种重要的免疫抑制分子，属于CD28超家族，主要表达于T细胞、B细胞和骨髓细胞，并且在活化的T细胞上表达上调。在自身免疫性疾病、慢性感染、肿瘤等疾病中，PD-1存在异常表达，近年来已成为免疫学研究的热点。针对PD-1的靶向治疗可以提高T细胞的反应活性，并在黑色素瘤、非小细胞性肺癌、肾细胞癌等多种肿瘤中有效[16-19]。

研究显示，乳腺癌组织中PD-1高表达的CD8+T细胞的数量与预后相关[20]。而同样有研究证实，乳腺癌中CXCL13+CD4+T细胞的PD-1及T细胞免疫球蛋白黏液素3(T cell immunoglobulin and mucin 3,Tim-3)表达上调，而这类前文中提到的Tfh-like细胞对B细胞的调控能力下降[21]。

3.2 CXCR5 CXCR5是趋化因子受体CXC受体家族的一员，也被称为Burkitt淋巴瘤受体1(Burkitt′s lymphoma receptor 1,BLR-1)，主要表达于成熟B细胞，而在T细胞中只有Tfh细胞持续高表达CXCR5。正常情况下，在配体趋化因子CXCL13的趋化作用下，CXCR5+的Tfh细胞迁移至淋巴滤泡中心，与B细胞共定位，进而发生相互作用。

而在乳腺癌组织中，Tfh-like细胞多为CXCR5-，可能是在Tfh细胞由生发中心迁移到肿瘤组织的过程中，由于肿瘤组织微环境的影响，呈现免疫抑制状态，使得Tfh细胞的CXCR5表达下调[1,13,22]。关于乳腺癌TDLN的研究提示，其中存在两种表达CXCR5的CD4+T细胞，分别是以Bcl-6+CXCR5+Foxp3-为特征的Tfh细胞和以Bcl-6+CXCR5hi/intFoxp3+为特征的滤泡调节性T细胞(T follicular regulatory cells,Tfr)[15]。源于初始Treg细胞的Tfr细胞对Tfh细胞起到抑制作用，并可能通过CXCR5的表达来限制生发中心反应以及自身抗体的产生[23,24]。

3.3 CXCL13 CXCL13是CXCR5的特异性配体，又被称为B细胞吸附因子1(B-cell attracting chemokine 1,BAC-1)或B细胞趋化因子(B lymphocyte chemoattractant,BLC)，是近年来的研究热点，包括神经性疼痛也与CXCL13及其受体CXCR5有关[25]。CXCL13可以发挥趋化作用，吸引B细胞，进而调控B细胞在体内的定位、成熟和分化。

Gu-Trantien等[13,22]研究CD4+肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor infiltrating lymphocytes,TILs)时发现，CXCL13基因的高表达在乳腺癌中提示更高的无病生存(Disease free survival,DFS)，多因素Cox分析显示，CXCL13是乳腺癌的独立预后因素。研究者以PD-1hiCD200hi为特征界定乳腺癌CD4+TILs中的Tfh细胞，由于CXCL13的表达与之明确相关，进一步将CXCL13+表达的Tfh细胞定义为TfhX13细胞，并认为这群细胞可能在乳腺癌微环境的体液免疫应答中起关键作用[13,22]。

3.4 ICOS ICOS是CD28家族成员，表达于活化的T细胞。其配体为ICOSL，表达于B细胞、巨噬细胞和树突状细胞，并在细胞活化状态下表达上调。ICOS是Tfh细胞发挥功能的重要分子，ICOS缺失会导致B细胞成熟障碍、抗体类型转换受阻[26,27]。ICOS敲除的小鼠，IL-21分泌能力下降，影响Tfh细胞的增殖和分化[28]。而B细胞分泌的ICOSL可以通过介导非典型NF-κB信号通路，调节Tfh细胞的分化[29]。

对乳腺癌组织TILs的研究表明，Tfh细胞ICOS呈中等程度表达[13]。该研究同时关注PD-1及ICOS的表达情况，实验显示，PD-1及ICOS可将CD4+TILs分为PD-1loICOSlo、PD-1hiICOSint、PD-1intICOShi三群。Tfh细胞呈PD-1hiICOSint表达，而PD-1intICOShi群同时有Foxp3高表达，故认为是活化的Treg细胞，发挥免疫抑制功能。

3.5 Bcl-6 Tfh细胞作为机体免疫调控的重要影响因素，其形成过程复杂。正常情况下，Bcl-6和CXCR5表达上调、ICOS信号激活等过程共同完成T细胞向Tfh细胞的分化[30]。B淋巴细胞诱导成熟蛋白1(B lymphocyte induced maturation protein 1,Blimp-1)是Tfh细胞分化的负调控分子，在Treg细胞和其他Th细胞中高表达[31]。转录因子Bcl-6可通过抑制Blimp-1协助Tfh细胞的形成，Blimp-1与Bcl-6间的表达水平是影响CD4+T细胞分化的重要决定因素[32,33]。亮氨酸链状转录因子(Basic leucine zipper transcription factor,ATF-like,BATF)是Bcl-6的直接调控分子，因而在Tfh细胞分化、生发中心形成及体液免疫中都有重要作用[34]。Mcdonald等[35]还就细胞因子对Bcl-6的影响进行研究，指出白细胞介素6(Interleukin 6,IL-6)可以使Bcl-6与CXCR5表达上调，IL-7则起抑制作用。Mathew等[36]发现介导E3泛素连接酶复合物组装的连接蛋白家族成员Cul3是Bcl-6的关键整合因子，Bcl-6-Cul3复合体通过发挥在T细胞活化和分化过程的负反馈调节作用，以限制Tfh细胞的过度分化。

目前认为生发中心的Tfh细胞表达PD-1、CXCR5、ICOS和Bcl-6，而血液中呈CXCR5+的Tfh细胞，本质上是生发中心产生的循环记忆Tfh细胞，以Bcl-6、PD-1、ICOS表达下调为特征。调节Th细胞向Th1细胞分化的转录因子T-bet(T-box expressed in T cell)在乳腺癌组织Tfh-like细胞中表达上调，而诱导Th细胞向Tfh细胞分化的转录因子Bcl-6呈中等程度表达[1]。在乳腺癌TDLN中，Faghih等[15]的研究提示，Bcl-6可以作为界定Tfh细胞的标志之一，但必须联合Foxp3，以区别同样呈Bcl-6+的Tfr细胞[24]。

3.6 IL-21 IL-21由Tfh细胞分泌，也是Tfh细胞的特征性细胞因子。IL-21主要通过诱导Tfh细胞分化，以自分泌的形式促进Tfh细胞表达CXCR5以及诱导Tfh细胞表达ICOS，调节Tfh细胞分化和迁移，辅助Tfh细胞调控B细胞功能[37]。IL-21的缺失会造成生发中心B细胞成熟障碍和浆细胞存活下降[38]。干扰素调节因子4(Interferon regulatory factor 4,IRF4)和信号转导与转录因子3(Signal transduction and transcription factor 3,STAT3)协同作用，可以间接使得IL-21分泌增多[39]。IL-21和白细胞介素4(Interleukin 4,IL-4)信号相互作用，影响体液免疫应答。Tfh分泌IL-21启动高亲和力抗体选择，而IL-4的分泌辅助浆细胞分化，产生抗体[40]。二者同时缺失，会损害生发中心的形成以及抗体应答[41]。

qPCR显示乳腺癌组织Tfh-like细胞有IL21基因高表达[13]。然而Zhu等[21]发现，若细胞同时有Tim-3表达，其分泌IL-21能力下降。尽管尚未有研究阐述乳腺癌TDLN中IL-21的分泌情况，但以IL-4+为特征的Th2细胞在TDLN中的表达与Tfh细胞呈正相关，提示Th2细胞可能与Tfh细胞在抗体应答中有协同作用[15]。

4 Tfh细胞在乳腺癌中的功能

尽管Tfh细胞在体液免疫中发挥重要的免疫调节功能，但目前有关乳腺癌Tfh细胞的研究报道很少且尚不深入。Gu-Trantien等[1]将乳腺癌组织中的Tfh-like细胞与B细胞共同分析，结果提示Tfh-like细胞分泌的重要细胞因子CXCL13与B细胞密切相关。FCM分析表明，CXCL13+TILs与CXCR5+B TILs相关，且Tfh-like细胞高表达的TILs与有Ki-67表达的B TILs相关。共聚焦显微技术说明，CXCL13+TILs可与向瘤床迁移的B细胞共定位，可能负责乳腺癌组织B TILs的招募以及三级淋巴样结构的形成。Faghih等[15]收集了47例乳腺癌患者的淋巴结标本以研究乳腺癌TDLN中CD4+淋巴细胞的表达谱，结果显示，其中30%有不同程度的癌转移。统计数据显示，对于淋巴结受累与未见淋巴结受累的患者，Tfh细胞比例无明显差异。除前文中提到的Th2细胞，Tfh细胞比例还与CD25+Treg细胞和Tfr细胞呈正相关，这表明Tfh细胞的分化和B细胞功能的实现可能受到CD25+Treg细胞和Tfr细胞调控[15,23,24]。

Tfh细胞主要通过表面分子及其分泌的细胞因子行使功能，然而这些标志物的表达在不同状态下存在差异。体外实验证实，乳腺癌Tfh细胞经过刺激后，Tim-3高表达的细胞相对于Tim-3低表达的细胞而言，分泌细胞因子CXCL13、IL-21的能力及自身增殖活性较低，从而将Tim-3+定义为耗竭的Tfh细胞的标志[21]。同时共培养实验提示，这群耗竭的Tfh细胞会导致B细胞分泌免疫球蛋白IgM、IgG、IgA的能力下降，弱化Tfh细胞对体液免疫应答的调节能力[21]。

5 Tfh细胞对乳腺癌预后的预测作用

分泌CXCL13的Tfh-like细胞在三阴性乳腺癌以及组织学分级3级的乳腺癌中表达上升[1]，其相关基因对乳腺癌的预后有预测作用。有研究分析与Tfh相关的基因，发现CD200、CXCL13、FLJ37440、ICOS、SGPP2、SH2D1A、VSTM3及PDCD1对乳腺癌生存有预测作用。这8个基因联合组成Tfh信号预测乳腺癌预后，高表达的Tfh信号提示更高的无病生存率(Disease ftee survival，DFS)。按照雌激素受体(Estrogen receptor,ER)和人类表皮生长因子受体2(Human epidermal growth factor 2,Her2)的表达情况对乳腺癌患者进行分型，发现上述结论在所有分型的乳腺癌患者以及Her2+或ER+Her2-的乳腺癌患者中均有意义[22]。

乳腺癌组织中检测到的CXCL13主要由Tfh TILs分泌，对乳腺癌的预后也有重要的预测价值。CXCL13基因是乳腺癌预后预测的独立影响因素。CXCL13高表达，提示患者DFS更高。这一结论同样在所有分型的乳腺癌患者以及Her2+或ER+Her2-的乳腺癌患者中均有意义，特别是对于Her2+乳腺癌患者。然而对于ER-Her2-的患者，CXCL13基因表达及由多个基因联合而成的Tfh信号表达尚未证实与预后相关[1,22]。

6 小结

Tfh细胞通过表面标志物的表达以及细胞因子的分泌，调节B细胞的增殖分化，辅助B细胞完成体液免疫应答，是一类重要的免疫细胞。Tfh细胞在多种疾病中发生变化，也存在于多种肿瘤组织中，是构成肿瘤微环境的一个重要组成部分。在乳腺癌组织中发现的Tfh细胞的表面标志物不同于生发中心的Tfh，目前对于此类细胞在乳腺癌发生发展和预后中的作用尚不完全清楚，特别是乳腺癌有多种分子亚型，加大了研究的复杂度。对乳腺癌Tfh细胞的进一步研究将有助于加深对乳腺癌肿瘤免疫微环境的认识，发现潜在的免疫治疗靶点，为难治型乳腺癌的治疗带来新的思路。