手足口病从感染到发病的分子机制

陈 鑫，赵彬彬，武 婧，彭婉君，刘江宁

(北京协和医学院比较医学中心，中国医学科学院医学实验动物研究所，国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)是由多种肠道病毒引起的一种儿童常见传染病，主要病原为肠道病毒71(enterovirus 71，EV71)型。轻度感染者可在手足口等部位出现疱疹、斑丘疹等症状；重症患儿可造成脑干脑炎、无菌性脑膜炎、神经源性肺水肿等并发症，具有较高的致残率和死亡率。HFMD被称为21世纪的“脊髓灰质炎”，颇受医学界关注。2008年5月至2011年12月期间，中国大陆地区手足口病发病例数为500多万例，其中死亡1870 例，且呈逐年增加态势[1]。目前手足口病的致病机制尚不明确，且由于缺乏理想的实验动物模型等原因使得手足口病研究进展缓慢。

研究手足口病致病相关基因可以为手足口病的预防、控制、治疗和预后判断提供依据，同时也可为新疗法、新药物提供基础[2]。但是目前与手足口病致病相关基因的研究报道较少，缺乏手足口病致病特异基因的研究。在本文中，将对已发现的EV71致病相关基因作一综述。同时，也将介绍遗传多样性小鼠，其复杂的遗传性状优势将在手足口病致病相关基因的研究中发挥重要作用[3]。

1 手足口病致病相关基因

目前，已经报道的手足口病致病相关基因主要有三大类，病毒特异性受体类、宿主免疫反应类和宿主病理损伤类。研究者发现这些基因与EV71感染和病情严重程度密切相关。下面将对这些致病相关基因作详细阐释。

1.1 病毒特异性受体类

1.1.1 清道夫受体B2(Scavenger receptor class B member 2，SCARB2)基因

SCARB2蛋白是一种膜蛋白，属于CD36分子家族，主要表达于溶酶体和内含体[4]。SCARB2是人类肠道病毒71的功能性受体，其主要负责EV71病毒的附着或脱壳。在中性和酸性条件下SCARB2结构的差异，表明SCARB2经历了关键的pH依赖性构象变化，其打开脂质转移通道以介导疏水性口袋因子从病毒体中排出，完成病毒脱壳过程[5]。研究者还确定了VP1蛋白与SCARB2连接所必需的关键残基，EV71病毒VP1蛋白第145位的谷氨酸(VP1-145E)。VP1蛋白第145位为VP1-145E的EV71病毒比VP1-145G/Q的EV71病毒在食蟹猴和SCARB2转基因小鼠中的毒力更强，且对宿主产生的抗体更具抗性[6]。Chen等[7]证实EV71病毒表面的壳蛋白VP1蛋白可与宿主受体SCARB2结合，能使病毒粒子的构象发生改变，这种变化在宿主内吞病毒的过程中显著增加而使病毒衣壳变形肢解，最终导致病毒基因组RNA释放到宿主细胞而完成感染。

有研究者发现，EV71病毒分布与SCARB2具有组织相关性，含病毒抗原的细胞几乎都有SCARB2的表达分布，中枢神经系统、呼吸系统、消化系统可能是EV71侵染的重要部位[8]。姚莎等[9]证明了SCARB2在重症手足口病患者、正常儿童以及成人的肺组织的支气管上皮、细支气管上皮、肺泡上皮细胞及炎症细胞中表达无统计学差异，提示SCARB2可能在重症肺水肿HFMD的感染过程中具有一定的作用。目前，未有其它文献报道SCARB2与手足口病病情严重程度有关。

综上，SCARB2与EV71结合，在EV71的侵染、复制、释放等感染过程中起重要作用。 SCARB2受体与HFMD病情严重程度的关系仍不是十分明确，有待于进一步深入研究。

1.1.2 P选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand 1，PSGL-1)基因

PSGL-1是具有同源二聚体结构的一种黏附分子，并且是表达于几乎所有白细胞表面的一种跨膜糖蛋白。PSGL-1是选择素P的配体，其通常与选择素P和趋化因子相互作用在炎症的早期阶段起作用。PSGL-1已被证明为EV71的功能性受体，EV71的衣壳蛋白VP1与硫酸化的PSGL-1特异性相互作用以促进病毒入侵[10]。SCARB2和PSGL-1两种受体的功能上有很大的差异，研究人员构建了转入人hSCARB2基因的L-SCARB2细胞和转入人hPSGL-1基因的L-PSGL-1细胞，再用EV71病毒株分别感染两种细胞，比较两种细胞感染EV71效率及结合EV71能力的差异。结果发现，L-PSGL-1细胞比L-SCARB2细胞能结合更多的EV71。然而，L-SCARB2的感染率却显著高于L-PSGL-1细胞，表明EV71的感染效率不由病毒与受体的结合能力决定[11]。

在重症HFMD患者肺组织中受体表达的研究中，与SCARB2相比，PSGL-1只分布于成人肺组织支气管上皮、细支气管上皮、肺泡上皮细胞及炎症细胞，在重症肺水肿HFMD患者和正常儿童中不表达[9]。由此推测，PSGL-1可能不参与重症HFMD的感染过程。

EV71受体的相关研究中，除SCARB2与PSGL-1是两种相对明确的受体，也报道了其它相关受体。例如，O2型聚糖通过与唾液酸化的葡聚糖如唾液酸连接(SA-linked O-glycan)可作为EV71受体介导EV71感染DLD-1肠细胞[12]。总之，很可能存在更多未知的EV71受体，有待于更近一步的研究。

1.2 宿主免疫反应类

1.2.1 人类白细胞介素4(Interleukin-4，IL-4)基因

IL-4主要由活化的T细胞产生，是Th2细胞的特征性细胞因子，当宿主遭到感染后介导机体体液免疫反应。EV71研究中发现重组VP1蛋白能够诱导高水平的Th2细胞反应[13]。Hoebee等[14]的研究发现普通组及重症组手足口病患儿IL-4水平均高于对照组，且重症组明显高于普通组。由此可见，IL-4可能是EV71患儿病情加重的一项重要指标。此外，基因测序分析发现IL-4基因中存在多个单核苷酸多态性基因座(Single nucleotide polymorphisms, SNPs)，如存在于启动子区域的IL-4-589CT基因SNP。该SNP的功能主要与IL-4的产生、活性及功能有关，同时发现与EV71患者重症程度也有相关性。在EV71重症患儿当中，IL-4-589CC基因型和C型等位基因显著高于健康儿童[15]。另外基因型为IL-4-589CC和IL-4-589CT的患儿的血浆中的IL-4水平明显比基因型为IL-4-589TT的患儿要高，但是IFN-γ和IFN-γ/IL-4的比率要比TT基因型要低。

研究还发现基因型IL-4-589CC和IL-4-589C的等位基因在EV71脑炎患儿中的频率更高[16]。这些研究说明IL-4作为重要的细胞因子介导EV71病毒感染的整个过程，而IL-4基因多态性又与患儿病症的严重程度密切相关。因此，早期筛查儿童IL-4基因多态性可能对预防该地区EV71爆发具有重要指导意义。

1.2.2 γ干扰素(Interferon-γ，IFN-γ)基因

IFN-γ是水溶性二聚体细胞因子，是II型干扰素的唯一成员，是Th1细胞的特征性细胞因子，主要由CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞产生。IFN-γ在抗病毒免疫过程中可以抑制病毒的复制，还可以调节其它免疫细胞的活动，诱导抗病毒蛋白在其他免疫细胞中的表达，在抗病毒效应和调节免疫应答中起着重要作用。EV71重症患儿中IFN-γ可以降低内皮屏障并增加血管通透性。此外，重症手足口病肺水肿患儿脑脊液中IFN-γ水平明显高于其他组织，提示IFN-γ可能与EV71感染造成的神经性病理损害有关。动物实验表明，感染EV71的小鼠经IFN-γ干预会发生肺水肿，说明IFN-γ在EV71感染患儿的病理过程中起重要作用，其水平高低可能与病情的严重程度有关[17]。另有研究表明，在HFMD患儿恢复期，IFN-γ水平下降，再次证明IFN-γ对HFMD病情进展的影响[14]。因此，在临床诊断和治疗过程中，IFN-γ水平具有非常重要的参考价值。

1.2.3 α肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF-α)基因

TNF-α是能直接杀伤肿瘤细胞而对正常细胞无明显毒性的细胞因子，主要由巨噬细胞和单核细胞产生。研究表明，随着手足口病患儿病情的加重，TNF-α水平明显升高，与病情严重程度呈正相关。刘松等[18]发现在EV71感染脑干脑炎和肺水肿患儿的外周血和脑脊液中TNF-α等炎症因子明显升高，随着病情加重，TNF-α持续升高，再次表明TNF-α的水平与病情的严重程度有关。刘培培等[19]发现TNF-α基因启动子区域308位点基因多态性与EV71中枢感染有相关性，TNF-α-308GG基因型可能为EV71的抵抗基因，保护儿童不受EV71的感染。当TNF-α基因的启动子区-308位点发生单核苷酸突变，G被A代替，阅读框内密码子发生改变，进而被限制性内切酶NeoI识别，阻断了TNF-α的表达，则有该类突变的儿童对EV71相对易感。综上，TNF-α在临床上可以作为评价患儿病情严重程度和预后的重要指标。

1.2.4 人类白细胞介素8(Interleukin-8，IL-8)基因

IL-8是人体免疫应答产生的重要趋化因子，当感染EV71时，体内的巨噬细胞分泌IL-8，这可使趋化性T细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞等到达炎症部位。并且它在启动天然免疫和获得性免疫介导的抗感染、抗肿瘤等方面起重要作用[20]。研究人员发现，手足口病患儿血清IL-8水平与疾病严重程度呈正相关，提示血清IL-8水平是EV71感染的关键因素之一，提示IL-8可作为临床上EV71感染严重程度的辅助诊断指标。Wang等[21-22]的研究进一步发现，虽然轻度EV71感染患儿与对照组之间的IL-8-251位点基因型分布以及等位基因频率无显著性差异，然而EV71脑炎重症组A等位基因频率明显高于轻度症状组。因此，携带有IL-8-251A等位基因的感染患者发展成为重症患者的概率明显高于T等位基因携带者[23]。然而，IL-8-251基因多态性与EV71脑炎患者易感性和病情严重程度之间的关系目前并不十分确切，需要进一步研究。

1.2.5 人类白细胞抗原(Human lymphocyte antigen，HLA)基因

HLA是人体已知的最复杂的基因系统，基因多态性使得不同的个体表达不同的HLA-I类和HLA-II类等位基因。HLA多态性的主要意义在于扩大个体可以应答的抗原范围并防止感染在人群中传播。一般认为HLA的多态性与传染病流行所施加的压力有关。目前研究发现手足口病与HLA基因之间存在明显的相关性。Chang等[24]发现HLA-A33，HLA-DR17与EV71感染密切相关，HLA-A33基因型在亚洲人群中普遍存在，在白种人中却很少发现。多变量分析发现，携带HLA-A33基因的儿童感染EV71患脑炎的几率更高，表明HLA-A33是重要的EV71致病相关基因。而HLA-A2基因则与患儿的心肺衰竭相关。HLA-G在病理生理条件下被认为是一种重要的免疫耐受分子，并且HLA-G在母婴免疫耐受反应中起关键作用[25]。Zheng等[26]研究者发现手足口病重症患儿的血浆中sHLA-G水平明显比对照组要高，并且在危重EV71感染患儿血浆中sHLA-G水平比重度EV71感染患儿中更高。由此可见，HLA-G基因的多态性与儿童对EV71的易感性紧密相关，说明在临床诊断过程中，sHLA-G水平可以作为辅助指标用于重症EV71感染患儿的诊断。

1.3 宿主病理损伤类

1.3.1 细胞自噬(Autophagy)

细胞自噬广泛存在于真核细胞内，是一种溶酶体依赖性降解途径，是细胞程序性死亡的方式之一，涉及细胞内成分及外源病原微生物的吞噬、降解，是机体内重要的保护和防御机制。近年来，研究发现细胞自噬在病毒感染中起着复杂作用。一方面，自噬可以通过识别、呈递病毒抗原，激活免疫应答和降解病毒，从而达到清除病毒的目的[27]；另一方面，病毒也可以利用某些机制逃避自噬，特别是RNA病毒，能够快速进化以应对宿主细胞自噬[28]。研究者发现EV71感染与自噬相互促进，随着感染时间和感染剂量的增加，自噬水平逐渐增强，而自噬诱导剂雷帕霉素又可增强EV71复制。张晓延等[29]发现EV71感染可促进LC3的型别转换和P62的降解，并诱导细胞自噬；当用3-MA 抑制细胞自噬时，细胞产生的感染性病毒颗粒数量减少。进一步研究发现，EV71非结构蛋白2BC可触发自噬溶酶体形成，利于病毒复制，用自噬抑制剂氯喹阻断自噬溶酶体产生后，EV71的病毒滴度、病毒拷贝和病毒蛋白均降低[30]。自噬和EV71病毒的研究才刚开始，因此需要进一步研究细胞自噬与手足口病之间的关系。

1.3.2 细胞凋亡(Apoptosis)

细胞凋亡是指基因控制的细胞自主有序死亡，可及时清除机体内的多余细胞和受损细胞，维持内环境稳定。EV71对人血管内皮细胞，T淋巴细胞和神经细胞的感染可引发感染细胞的凋亡并引起相关疾病的症状[31]。EV71触发细胞凋亡具有多样性，触发途径因感染的细胞种类不同而异。EV71感染T淋巴细胞，引起FasL表达，导致其凋亡。EV71感染神经细胞，可激活Abl-Cdk5信号，并导致其凋亡[32]。EV71感染人血管内皮细胞，可引起多种细胞因子升高，参与集体炎症反应，同时也可激活神经酰胺等凋亡信号转导[31]。EV71触发细胞凋亡具有偶联性，凋亡信号的转导系统与细胞增殖和分化过程中某些环节有着交叉、偶联。如在EV71感染的早期阶段(6 h内)，PI3K/Akt 和MAPK/ERK 的磷酸化导致GSK-3 活化的抑制，随后的BAD、Caspase-9和FKHR无法完成磷酸化，阻止宿主细胞的凋亡。Akt催化多种底物，其中包括GSK-3，其通过磷酸化多种转录因子和翻译起始因子，参与细胞代谢，增殖，分化过程[33]。EV71触发细胞凋亡具有多途性，EV71感染可经过多种信号途径触发凋亡，其中并没有起关键枢纽作用的关键点。

细胞凋亡可能是EV71感染引起严重疾病的发病机制之一，在目前缺乏特异性、高效的抗病毒药物的情况下，通过切断凋亡相关信号转导途径来抑制EV71感染引起的细胞凋亡为治疗提供了新的思路和方向。但是目前相关的研究较少，很多结论仍旧停留在猜想阶段，EV71引起细胞凋亡的信号转导有待于进一步研究。

2 手足口病致病相关基因研究新工具的应用展望

遗传多样性小鼠(Genetic diversity mice)是通过对现有的小鼠近交品系进行遗传分析，最终选出来5个实验室动物品系和3个野生动物品系，进行杂交传代而获得[34]。遗传多样性小鼠具有丰富的性状和丰富的遗传多态性，可以模拟人基因多样性，是研究人类复杂性状的新型工具。能够最大程度地体现不同人群对病因敏感的差异性，可应用于精准医疗、基因功能发现、疾病模型建立和人类复杂性状疾病的研究[35]。

遗传多样性小鼠作为一种新的动物资源在医学领域的应用越来越多，研究者成功利用遗传多样性小鼠建立了埃博拉病毒的感染模型，让遗传多样性小鼠成功应用于传染病模型的建立[36]。然而尚未有利用遗传多样性小鼠进行手足口病致病相关基因的研究。相比单一遗传背景的小鼠，遗传多样性小鼠在手足口病致病相关基因的筛选中效率大增。借助200多个遗传多样性小鼠品系，利用标准化的方法感染EV71病毒，通过GeneMiner(http://192.168.1.9/Geniad2/)分析得到的相关数据，从而获得手足口病易感和抵抗相关的基因簇，再通过其他数据库对获得的基因簇进行分析筛选。之后对选取的候选易感和抵抗相关基因进行基因敲除，利用基因敲除小鼠进行进一步的验证实验。

3 结语

综上所述，手足口病致病相关基因的报道主要可以分为三大类，病毒特异性受体类、宿主免疫反应类和宿主病理损伤类。本文认为，病毒特异性受体除SCARB2和PSGL-1较为明确以外，其它受体的相关研究较少，应加大探索研究力度，寻找更多特异性受体。同样，细胞凋亡和细胞自噬与手足口病致病机制的相关研究处于初期阶段，需要进一步的深入研究。遗传多样性小鼠丰富的性状差异和丰富的遗传多态性优势，是研究手足口病非常好的动物资源，它可以高效地筛选手足口病相关致病基因，对于揭示手足口病的致病机理、新药物干预靶点的研究、指导临床诊断、治疗和预后以及手足口病的预防和应对都有着非常重要的作用和意义。